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急性髓系白血病微小残留病监测:二代测序应该成为临床常规吗?

放大字体  缩小字体 发布日期:2017-12-21  来源:白血病·淋巴瘤
核心提示:急性髓系白血病(AML)是一类具有很强异质性的恶性血液病。AML患者的疗效差异很大,在当前的治疗模式下约20%的患者诱导后无法获得缓解,约30%~40%的患者缓解后复发。个体化治疗的目标是让每位患者接受最合适的治疗以获得最大可能性的治愈,而患者个
急性髓系白血病(AML)是一类具有很强异质性的恶性血液病。AML患者的疗效差异很大,在当前的治疗模式下约20%的患者诱导后无法获得缓解,约30%~40%的患者缓解后复发。个体化治疗的目标是让每位患者接受最合适的治疗以获得最大可能性的治愈,而患者个体化治疗方案的选择是基于精准的预后分层。随着诊断技术的进步,预后相关的各项指标不断被发现和验证,预后分层已成为当前AML诊治不可缺少的组成部分。

预后分层指标分为初诊和治疗过程两大类。患者发病时的表现代表了自身生物学特征,具有重要预后意义。细胞(分子)遗传学特征依然是当前AML患者预后分层的基本框架,近年来新发现的一些基因突变逐渐被整合到其中。例如,欧洲白血病网络(ELN)和美国国立综合癌症网络(NCCN)指南均把FLT3-ITD和NPM1突变情况纳入分层指标。除此之外,在2017年的ELN指南中,TP53、RUNX1及ASXL1突变也被新纳入预后分层体系中。除了初诊指标,治疗随访过程中微小残留病(MRD)反映了AML患者对治疗的反应,亦成为当前基本的预后分层指标。

一、MRD监测的临床意义

已有很多数据显示了MRD监测在AML预后分层及指导临床治疗方面的作用,其中最强烈的证据来自于急性早幼粒细胞白血病(APL)。欧洲前瞻性临床试验证实,系列监测的PML-RARα融合mRNA水平是APL患者无复发生存的最强预测指标,并且MRD指导下的抢先砷剂治疗是降低临床复发率的有效手段[3]。随后许多研究证实了AML分子学随访监测(如RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11、NPM1突变等)对于复发的强烈预示作用以及MRD指导下临床干预的作用,针对化疗各个时间点、移植前后各时间点及动力学变化方面的监测和干预均有报道,不过往往都是回顾性研究[4,5,6,7]。当前,在AML患者MRD监测的时间点以及临床干预的阈值方面尚无明确结论,正在进行的多个有关MRD的临床试验将提供充分证据。

二、MRD分子监测的方式

细胞和分子水平是当前MRD监测不可缺少的两个方面,前者基于多参数流式细胞术(MFC),后者则基于聚合酶链反应(PCR)技术。AML的分子学异常检测包括融合基因、突变和基因过表达。与传统定性PCR技术相比,实时荧光定量PCR(RQ-PCR)技术具有定量准确、操作简便等特点,因而近10余年来成为分子学异常检测的主流技术。AML中常见的融合基因包括RUNX1-RUNX1T1、CBFB-MYH11、PML-RARα以及MLL相关融合基因,融合mRNA水平检测是RQ-PCR检测的最具优势的分子学异常。此外,NPM1突变的A、B和D三种类型占全部类型约90%,亦可采用RQ-PCR进行敏感而定量的检测,因而,临床常规中常见融合基因及NPM1突变检测均采用RQ-PCR。然而,只有约50%的AML患者具有这些异常,其他患者可以采用异常过表达的mRNA水平来反映MRD,以WT1为代表。不过,由于正常造血干/祖细胞表达造成的背景值以及基因表达水平的影响因素较多,使得这类过表达基因用于MRD监测的敏感性和特异性并不十分令人满意。

直接的基因突变检测技术是测序,Sanger测序是经典的检测方法。21世纪初,二代测序(NGS)技术应运而生并迅速发展,它实现了多基因多样本并行的高通量测序。在NGS应用于AML的初期研究阶段,多个研究组采用全基因组或全外显子组测序技术,发现初诊AML患者存在多种基因突变,这些可能具有预后意义的一系列基因突变成为突变组合,采用靶向测序法检测特定的基因突变具有经济、实用、快速的优点,是当前临床常规中初诊AML患者基因突变的筛查方式。NGS的另一个特点是可以对突变比例准确定量,此外,通过提高检测深度有可能提高敏感度,因而,采用NGS随访检测AML患者初诊筛查出的突变有可能成为新的MRD监测指标。NGS的应用使得几乎所有AML患者都能在初诊时筛查出基因突变,而许多基因的突变位点和类型多样,采用RQ-PCR技术检测难以实现,因而通过NGS使AML患者普遍接受MRD分子监测成为可能。

三、NGS监测MRD的临床意义

几个研究组先后报道了采用NGS随访AML患者初诊时的突变用于监测MRD的临床意义。2015年,美国华盛顿大学首先报道了采用NGS检测AML患者治疗后突变谱的临床意义[9]。入组该研究的71例AML患者中,有50例同时具有初诊和诱导缓解时的样本并均进行了NGS突变谱检测,结果显示,诱导缓解时具有至少1种高水平突变[突变型等位基因频率(VAF)>2.5%,相应于5%的幼稚细胞]患者的无事件生存时间明显短于无高水平突变者(6.0个月比17.9个月,P<0.001),并且该结果同样适用于中危核型组患者。最近,法国学者通过高敏感靶向NGS检测69例AML患者诱导缓解时的突变发现,存在≥2种突变(突变比例>0.4%)的患者复发风险明显增高(P=0.000 1)。此外,Getta等研究了62例接受异基因造血干细胞移植的AML患者,结果发现移植前NGS与MFC监测的MRD结果存在高度一致性(71%),并且NGS监测MRD能够提供额外的信息,NGS与MFC监测MRD均阳性的患者比其他患者具有更高的复发率(P=0.008)。

还有一些研究通过采用NGS随访有限的突变基因或个例AML患者,证实NGS监测MRD具有预后意义。FLT3-ITD是AML中常见的突变类型(发生率约20%),并且是明确的不良预后标志,其还具有不稳定的特点。有2项研究分别采用NGS技术随访监测FLT3-ITD,发现AML患者初诊时可能存在多种FLT3-ITD突变型,在治疗过程中及复发时有可能发生突变型转变,采用NGS检测技术能够实现对FLT3-ITD各种突变型的全面监测。Debarri等以31例入组法国ALFA-0701临床试验并有NPM1突变的AML患者为研究对象,采用NGS技术随访监测与NPM1突变同时存在的IDH1/2及DNMT3A突变,结果显示IDH1/2突变水平能够预测全部的复发及疾病演化。Malmberg等则是针对1例AML患者,采用全外显子测序检测初诊样本找出各种基因突变,并以此作为随访监测的分子标志进行NGS检测,这些突变的动力学均与RQ-PCR检测的NPM1突变一致并均可预测复发。

到目前为止,尽管有关NGS用于检测AML患者治疗过程中突变的研究有限,但其在MRD分子监测方面初步显示具有临床意义。此外,AML患者初诊时具有比例不等的多基因突变,这表明存在多个亚克隆,NGS监测MRD可以同时检测多个基因,了解克隆演变过程,可能有助于治疗药物及方式的选择。因此,结合NGS检测的特点及已发表的数据可以预见,NGS很有可能成为临床常规MRD分子监测的一个重要手段。

四、NGS监测MRD用于临床常规的挑战

成为临床常规的检测指标需满足以下要求:

(1)具有临床意义;
(2)结果稳定、可靠、具有可比性;
(3)操作简便;
(4)可接受的性价比。

尽管NGS监测MRD已显示出成为临床常规的可能性,但是除MRD监测共同面临的问题之外,还有一些NGS相关的重要问题尚不清楚,在真正走向临床常规之前还需更多证据。

1. 监测指标的选择

在当前的临床常规中,AML患者往往通过靶向测序几十甚至上百个基因寻找突变。由于各个突变的特点和意义不同,是否所有筛出的突变均有必要用于MRD监测目前尚不十分清楚。支持所有突变均监测的证据是,由于克隆演变的存在使得一些突变存在不稳定或发生类型转变,通过全部筛查可以减少漏诊。此外,有研究通过诱导缓解时随访全部初诊突变患者证实,突变清除的个数与复发相关。然而有些基因突变(如DNMT3A、TET2、ASXL1等)同时存在于白血病细胞和前白血病细胞中,是克隆性造血的表现,其MRD监测的意义并不明确。以DNMT3A突变为例,多项研究证实该突变在AML患者诱导缓解后往往持续存在,并且其是否存在与复发和生存无关。另外,尽管当前初诊筛查的AML基因突变组合可达到上百个基因,当前的关注点主要在常见基因突变,其他发生率较低的突变的随访意义仍然缺乏。在临床意义未确认之前,尚无法用于临床常规MRD监测。

2. 敏感度的要求

RQ-PCR技术具有相对不变的敏感度,对于NGS而言,通过提高测序深度可以提高敏感度,然而检测敏感度同样受测序环境即测序平台准确性的影响,提高测序深度的同时发生错误的概率也在增加。因此,当前采用NGS筛查多基因突变时,敏感度往往在1%~5%。对于多基因突变NGS随访意义的评估亦停留在类似的敏感度下,并且仅就诱导缓解时间点进行了统计学分析。为满足敏感度的要求,已有一些高敏感的NGS检测试剂被研发并应用。

就临床常规而言,检测成本是非常现实的问题。目前,尽管NGS检测成本大幅下降,但仍然比较昂贵,无论是监测指标的数量还是敏感度的改变都会明显影响检测成本,因而必然会涉及性价比的问题。因此推测,NGS用于临床常规AML的MRD监测将会从具有明确意义的有限基因逐步开始。

NGS技术的应用加强了我们对AML分子学异常的了解,尽管目前证据尚少,但其已显示出应用于临床常规MRD分子监测的潜力。MRD的临床意义还需要更多前瞻性临床试验数据的支持。在当前情况下,医生需结合患者MRD指标、自身生物学特征以及治疗史进行综合判定,以发挥最佳治疗指导作用。

来源:秦亚溱. 急性髓系白血病微小残留病监测:二代测序应该成为临床常规吗? [J]. 白血病·淋巴瘤,2017,26( 11 ): 646-648,654

 
 
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