串联质谱在新生儿筛查中应用进展

串联质谱用于遗传代谢病的筛查诊断，是开展先天性甲 状腺功能减低症筛查以来新生儿筛查史上最重要的进展。它 主要通过数十种小分子的分析，筛查出包括氨基酸病、有机 酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺陷在内的!$ * %$ 多种遗传代谢 病，大大提高了筛查效率，实现了“一种实验检测一种疾病” 到“一种实验检测多种疾病”的转变。
一、概述新生儿筛查是指在新生儿期通过对某些危害
严重的遗传代谢缺陷、先天性疾病进行群体筛查，早期诊治， 从而避免或减轻疾病的危害。始于!$ 世纪+$ 年代早期的新 生儿筛查，从,-./012 的细菌抑制法到放射免疫分析法、酶 免疫吸附实验等，都属于“一种实验检测一种疾病”的方法。 其间，虽然不断出现新的筛查技术如气相色谱质谱’,3 4 56)、液相色谱质谱’73 4 56) 等，但所有这些技术具有分析 周期长、样品通量较低、假阳性较高等缺点，不能满足大规模 的新生儿筛查。
近年发展起来的串联质谱法’.89:2; ;8<< <=2>.0?;2@ .0A B56 456)具有快速、灵敏和选择性强等特点，自从应用于 新生儿筛查以来，大大扩展了筛查的疾病谱。56 456 主要通 过对新生儿干血滤纸片中的氨基酸、有机酸、酰基肉碱的分 析，一次实验可以同时筛查出包括氨基酸病、有机酸代谢紊 乱、脂肪酸氧化缺陷在内的!$ * %$ 多种遗传代谢病，大大提 高了筛查效率。
二、56 4 56 的基本原理质谱主要是将被测物质分子
电离成各种质荷比;4 C 不同的带电粒子，然后应用电磁学原 理，使这些带电粒子按照质荷比大小的空间或时间上产生分 离排列成的图谱，通过测定粒子峰的强度，以此获得确定化 合物的分子量、分子式。56 456 是由! 个质谱仪经& 个碰撞 室串联而成，其进行新生儿筛查的原理51DD19E.?9F& B ! G 和 H8 三、56 456 的筛查
&I 样品准备：56 4 56 分析的样品准备采用干血滴滤纸 片，打孔后置于(+ 孔板中，加入同位素内标，经甲醇抽提，氮 气吹干，盐酸加热酸化，再次氮气吹干完全干燥，在有机相中 溶解，进行上样测定。其中同位素内标的使用是56 4 56 定 量分析的主流，标记的位置应定在目的分子较稳定的区域， 同时也应考虑同位数内标之间相互干扰等因素，才能达到分 析准确。如在酪氨酸分析中，使用&%3+ @ 环@ 酪氨酸作内标，不 会随储存时间而衰减，因此比酪氨酸J :" 更稳定FK G；用赖氨酸 J :&$ 代替赖氨酸J :% 可以减少谷胺酰氨J :K 的中性碎片丢 失中的脱氨基产物对赖氨酸J :% 的碎片离子的影响F+G。各种 软离子技术，尤其是电喷雾电离’L6M)与56 4 56 相结合，降 低了对样品的纯度要求，而且使得进样自动化，从而适应了 新生儿高通量的筛查F% B" G。
!I56 4 56 分析：应用于新生儿筛查的56 4 56 主要执 行% 个扫描模式：母离子扫描、中性丢失扫描和选择反应检 测或多反应检测。在母离子扫描中，第二个质谱仪选择特征 的碎片离子，测定第一个质谱仪中的所有母离子。在中性丢 失扫描中，! 个质谱仪在同样的速度和方式下扫描，测得的质 谱显示出具有相同的碎裂方式的离子。在进行选择反应检测 时，! 个质谱仪是静止的，对每一样品有选择地检测某些母离 子@ 碎片离子对。
数据获取的方法依据分析目的不同而不同。它可以是单 一的功能扫描，如氨基酸的中性丢失扫描和酰基肉碱的母离 子扫描，也可以是多反应检测分析F# G。大多数!@ 氨基酸在碰 撞诱导裂解’3MN) 作用下产生&$!N8 的中性碎片丢失，少数 氨基酸产生K+N8’甘氨酸)、&+&N8’精氨酸)、&&(N8’鸟氨酸) 的中性碎片丢失，因此氨基酸分析一般采用中性丢失扫描。 而在酰基肉碱分析中，因其结构特点与氨基酸不同，经3MN 后产生的是具有共同结构的OKN8 的碎片离子，所以主要采 用母离子扫描方式。但如果同时进行氨基酸和酰基肉碱分 析，较理想的分析应该是多反应检测分析与母离子扫描或中 性丢失扫描相结合使用，并且在某些关键的物质分析中几种 方式同时使用。每一扫描功能的数据获取过程有一定的时间 分配，主要依据样品流量、扫描质量范围、扫描速度、相应分 析物的量、所需求的数据质量及其他参数而定FK 、O G。通过使用 所谓的计算机辅助的代谢图谱运算法’3P5QP) 的自动化分 析系统来变换不同的设备模式处理复杂的数据，能够在! 分 钟内精确地分析不同物质的组成，从而更能适应高通量的新 生儿筛查F" G。
%I56 4 56 结果处理：遗传代谢病是由于人体内某些酶、 膜或受体等生物合成的遗传缺陷，引起细胞和体液内毒性中 间产物积聚或必需代谢产物的缺乏，在血液中表现为相应代 谢物如氨基酸、酰基肉碱的含量增高。56 456 结果处理的一 个重要方面是将代谢物质谱转换成有意义的临床结果，这一 过程主要通过计算代谢物离子率而得，即未知代谢物的丰度 与相应内标丰度之比，然后在预先建立的标准曲线上将比率 转换成浓度，以筛查诊断相应的遗传代谢缺陷病。也可采用 相应的几种代谢物之间的离子峰丰度比来分析筛查F( G。方法 的选择对结果分析有很大的影响，如在苯丙酮尿症’QRS) 筛 查中，使用Q/2 4 TA0 比的精确性优于Q/2 离子率，而且还可 区分引起苯丙氨酸升高的几种情况：经典的QRS、UV" 缺乏 引起的QRS、一过性的苯丙氨酸升高F&$ G。而在丙酸血症筛查 中，因为乙酰肉碱（3!）在;4 C !+$ 的质谱信息可能受到谷氨 酸双丁基脂的干扰，因此使用丙酰内碱（3%）离子率比用3% 4 3! 更有意义F" G。
56 4 56 结果分析也受到不同因素的影响，如肉豆蔻酰 肉碱（’$%）、棕榈酰肉碱（’$(）在早产儿中的浓度下降，而对于 因母亲营养障碍导致的早产儿其)*+ , -./ 率却有所增 高0# 1。酪氨酸浓度升高除酪氨酸血症2 型所致外，还见于其他 疾病，所以在酪氨酸血症2 型的分析筛查时，当仅仅酪氨酸 浓度升高，可通过快速分光光度仪间接地检测琥珀酰丙酮酸 来加以分析，以排除其他疾病0$$ 1。
34 , 34 还不能很好地区分同分异构体，如在5 碳酰基 肉碱分析中，甲基丁酰肉碱和异戊酰肉碱（’5）有着同样的质 量和相应的’5 标记，因此’5 既可以表示!6 甲基丁烷辅酶7 脱氢酶缺乏，也可表示异戊二酸血症，这时就需要其他技术 8如气相色谱技术9 分析各自的代谢产物8分别为甲基丁酰肉 碱和异戊酰肉碱9 0( 、: 1。在枫糖尿症834;<9 的筛查中，=, > $&& 的丰度既可以是亮氨酸、异亮氨酸，也可以是别构异亮氨 酸，尤其还存在羟脯氨酸、丙酰甘氨酸的干扰，对于经验不丰 富的操作者来说更加难以区分，但如使用多级串联质谱8如 ?’ ,34 ,349则可避免这一问题0$! 1。
%@ 新生儿筛查的扩展：虽然34 , 34 早在$AA" 年就已 应用于新生儿筛查，但直到最近几年才在一些发达国家作为 常规使用。随着技术的发展和对遗传代谢病认识的深入，不 断地有新的疾病加入34 , 34 分析的行列，能够筛查包括属 于氨基酸病的)B;、34;<、同型胱氨酸尿症、酪氨酸血症2 型、酪氨酸血症!型、组氨酸血症、瓜氨酸血症，属于有机酸 代谢紊乱的丙酸血症、戊二酸血症2 型、戊二酸血症!型、异 戊酸血症及属于脂肪酸氧化缺陷的中链酰基辅酶7 脱氢酶 缺乏83’7<9、长链酰基辅酶7 脱氢酶缺乏8?’7<9、极长链 酰基辅酶7 脱氢酶缺乏8C?’7<9、肉碱棕榈碱转运酶缺乏 8’)-229、肉碱, 酰基肉碱转位酶缺乏、肉碱转运体缺乏等大 约!" D #" 多种疾病。尤其是脂肪酸氧化缺陷在最近几年逐 渐得到重视，估计#E D (E 的婴儿猝死综合征可能是由脂肪 酸氧化缺陷所引起，因此不断地有作者通过34 , 34 把这类 疾病列入新生儿筛查中。但是，除了)B;、34;<、3’7< 等 几种常见疾病外，其他遗传代谢病还局限于少数病例的筛查 分析，还需要进行大量的回顾性研究才能列入常规的新生儿 筛查0$# D$5 1。
5@ 假阳性与假阴性：34 , 34 技术优于其他技术的特点 之一就是大大降低了筛查诊断的假阴性和假阳性，尤其对已 作为常规筛查的疾病。有报道筛查苯丙酮尿症数十万例，达 到了零错误率。但对于某些有机酸代谢紊乱、脂肪酸氧化缺陷 病来说，34 ,34 还不能作为一个诊断实验。有人曾报道$ 例戊 二酸血症2 型的病人出现34 , 34 分析假阴性的情况0$( 1。此 外，如果母亲在分娩前使用过含有三甲基醋酸的抗生素，就 可导致新生儿血点中含有与异戊酰肉碱有同样分子量的三 甲基醋酸酰肉碱，从而导致异戊酸血症诊断的假阳性0$: 1。 四、34 , 34 对其他遗传代谢病的分析34 , 34 除了 用于氨基酸病、有机酸代谢紊乱和脂肪酸氧化缺陷筛查外， 还可用于溶酶体贮积症8?4<9 的诊断分析，已证实硫酸脑苷 脂在异染性脑白质营养不良、葡糖脑苷脂在戈谢氏病中皆可 以通过34 ,34 分析0$&1。也有人试图利用对干血点中结合胆 汁酸的定量分析来筛查胆汁淤积的肝胆管性疾病，但由于结 合胆汁酸与氨基酸、酰基肉碱的理化性质不一样，其标本必 须在出生后: D $" 天且在食后! D # 小时开始采集，同时标 本应避光保存，才能保证筛查的准确性，因此还存在许多有 待解决的问题0$A 1。
综上所述，34 , 34 技术正迅速地成为新生儿群体筛查 的有力工具，随着各国科学家的努力，将会有更多的疾病可 以通过34 ,34 分析筛查，并且技术也会更趋于成熟。