作者：王国庆 刘运德 佟心
单位：天津市口腔医院检验科、天津医科大学临床技能中心
【摘要】全唾液主要由唾液腺分泌，龈沟液、黏膜渗出液及微生物分泌物也参与其组成，由于其具有无创性、简便性、时效性、普及性、可靠性且含有丰富的生物学信息等优势，有可能成为血液和尿液的替代物，被进一步定义为“生物标志物的潜在池”。外源性和内源性因素均可影响唾液代谢组，这些因素包括昼夜节律、年龄、性别差异、日变化、腺体刺激、各种健康习惯（如口腔卫生、吸烟、一般健康和饮食）以及唾液收集程序、样本完整性、存储条件、样本容量等。代谢组学是对生物体进行病理生理刺激或遗传改变后，分析代谢物含量变化，从而探索代谢应答机制的学科。唾液代谢组学运用高通量技术系统地研究唾液中的小分子量物质（包括中间代谢产物、激素和某些信号分子等），被认为是检测各系统疾病的新兴潜在工具。唾液代谢组学在口腔疾病的发病机制研究、风险预测、筛查、诊断、病理分级和预后评估以及口腔致病微生物的快速鉴定中均显示出其他研究方法所不具备的优势。唾液生物标志物不仅与口腔疾病有关，而且与远端组织器官的疾病有关，比如乙型肝炎、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、多型胶质母细胞瘤、阿尔茨海默病等均有唾液代谢组学变化。
虽然唾液中检测到的大部分代谢物已经被鉴定出来，但是在解释这些不同代谢物的临床意义方面仍有大量的工作要做。随着代谢组学技术及分析方法的发展，唾液代谢组学未来研究的重点将是确定唾液代谢物的功能作用，并在实现标准化的收集程序的基础上与基因组学、蛋白质组，转录组和微生物组等多维度综合评估分析，从而更加深入彻底地认识口腔及全身系统性疾病。
【关键词】唾液；代谢组学；生物标志物
全唾液主要由唾液腺分泌，龈沟液、黏膜渗出液及微生物分泌物也参与其组成，由于其具有无创性、简便性、时效性、普及性、可靠性且含有丰富的生物学信息等优势，有可能成为血液和尿液的替代物，被进一步定义为“生物标志物的潜在池”。代谢组学是对生物体进行病理生理刺激或遗传改变后，分析代谢物含量变化，从而探索代谢应答机制的学科。唾液代谢组学运用高通量技术系统地研究唾液中的小分子量物质（包括中间代谢产物、激素和某些信号分子等），被认为是检测各系统疾病的新兴潜在工具。本文就唾液代谢组学的研究进展作一综述。
一、唾液成分与功能
唾液是一种复杂的液体混合物，由多种唾液腺分泌的混合物组成，其中包括腮腺、下颌下腺、舌下腺和其他小腺体。唾液呈微酸性（pH值6.0-7.0），健康人每日分泌唾液量为1.0-1.5L，由水(99%)、蛋白质（0.3%）、无机物质（0.2%）和有机物组成[1]。蛋白质主要包括淀粉酶、半胱氨酸、乳铁蛋白、粘蛋白、溶菌酶、转铁蛋白和各种免疫球蛋白，其中淀粉酶含量最为丰富。无机物包括钠、钾、钙、镁、氯以及碳酸盐和碳酸氢盐等。有机成分主要包括淀粉酶、过氧化物酶、脂肪酶、溶菌酶、乳铁蛋白、激素和生长因子[2]。唾液有促进食物消化、润滑口腔、感知味觉及免疫相关的功能。
二、标本采集对唾液代谢组学的影响因素
唾液代谢组学与它对昼夜节律、腺体刺激、饮食、年龄、性别、收集程序、样本完整性、存储条件、样本容量等的敏感性有关[3-4]。在收集数据或分析时没有考虑到这些因素可能会导致错误的结果，在取样时必须考虑引起代谢物变化的各种因素。如图1所示，外源性和内源性因素均可影响唾液代谢组[5]。
图1. 唾液代谢组学的影响因素
唾液成分的一个重要影响因素是样本采集的时间，因为包括总蛋白在内的唾液成分显示出昼夜节律[6]。代谢谱分析显示，大多数（85%）唾液代谢物没有明显的昼夜节律，但其余15%的唾液代谢物具有昼夜节律效应[7]。这些昼夜节律调节的代谢物大部分是氨基酸，例如酪氨酸和精氨酸反映了总蛋白质浓度的昼夜节律。唾液代谢含量也被发现独立于饮食，因为饮食标准化可以减少尿液代谢成分的个体间差异，但唾液没有观察到类似的减少[8]。唾液代谢组学特征观察到明显的日内变化，应严格控制采样时间，以最大程度减少唾液代谢组学在临床上的意外偏倚[9]。此外，餐后样本收集时间影响唾液代谢物的水平，以晚餐后禁食12小时最佳[10]。
唾液代谢成分也受刺激和某些参与行为的影响。柠檬酸刺激导致了大多数代谢物的减少[11-12]。虽然这种减少主要是由于唾液中液体含量的增加而稀释，但代谢物并未按比例稀释，这表明代谢物具有特定的作用[12]。与柠檬酸刺激相比，咀嚼刺激也会引起代谢产物浓度的变化。柠檬酸刺激降低了代谢物的浓度，而Okuma N等[13]的研究发现咀嚼刺激会导致大多数代谢物的浓度增加，这归因于咀嚼时会从口腔生物膜中释放代谢物的机械作用。
对生理和环境因素的大型质谱研究结果表明，唾液代谢物谱不受生活方式因素的显著影响，如饮酒、禁食、口腔卫生、药物使用或营养补充；但受性别的影响最大，其次是收集方法，然后是吸烟[14]。Takeda I等[12]的研究显示男性唾液中的醋酸酯、甲酸酯、甘氨酸、乳酸、甲醇、丙酸酯、丙二醇、丙酮酸、琥珀酸和牛磺酸的浓度显著高于女性。当考虑女性参与者时，月经状态对唾液代谢分析没有影响[15]。收集方法是唾液代谢组学研究的另一个注意事项，使用收集系统而不是被动流口水被确定为样本中外源分析物的潜在来源[16]。吸烟者唾液中柠檬酸、乳酸、丙酮酸和蔗糖的浓度高于非吸烟者，而甲酸盐的浓度低于非吸烟者[12]。
三、唾液代谢组学在不同疾病中的应用
唾液满足了用于疾病诊断及监测所必要的标准，如非侵入性收集、疾病特异性标志物、标本易于处理及保存等。此外，唾液还能避免传统采血或组织活检方法带来的疼痛、焦虑和感染风险，多次连续采样的可行性也是唾液用于疾病监测的一个额外优势。尽管唾液中的细胞分子或标记物浓度较低，但与血液不同，唾液不会凝结，分析物也很稳定，通过分子生物学和代谢组学领域的一些技术和仪器的进步，这个低浓度的问题已经在很大程度上得到了解决[17]。
唾液代谢组学在口腔疾病的发病机制研究、风险预测、筛查、诊断、病理分级和预后评估以及口腔致病微生物的快速鉴定中均显示出其他研究方法所不具备的优势。随着代谢组学的不断发展，其在口腔疾病方面的探索性研究取得了一定的成果。口腔癌是唾液代谢组学研究最广泛的，研究者们一直在寻找一种新的早期诊断方法[18-19]。甘氨酸、脯氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸这四种代谢物与早期口腔鳞状细胞癌相关[20]。最近的一项研究还发现唾液代谢组学可以将扁平苔藓与口腔癌分开，发现区别性代谢物包括吲哚乙酸、腐胺和磷酸乙醇胺在口腔癌中上调[21]。通过唾液代谢组学分析，口腔癌和包括角化和炎症在内的癌前不典型增生也能与其他临床上相似的病变进行鉴别诊断[22]。Sridharan G等[23]发现口腔白斑和口腔鳞状细胞癌患者的唾液代谢产物明显改变，有必要评估个别代谢物在监测口腔白斑恶变和改善口腔鳞状细胞癌预后中的临床价值。
Li Y等[24]在复发性阿弗他溃疡患者和健康个体的唾液代谢组学对照研究中，共发现了206种显著的鉴别代谢物，这些代谢物涉及色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和其他代谢途径，复发性阿弗他溃疡患者唾液中硫酸雌酮和硫酸脱氢表雄酮这两种常见的循环类固醇明显降低。
Kuboniwa M等[25]的初步研究中5-戊二胺、5-羟脯氨酸、3-苯丙酸和鸟氨酸等代谢物被确定为牙周炎症的潜在生物标志物。Liebsch C等[26]进行了唾液代谢改变与年龄和口腔健康状况的相关性的研究，该研究发现在年轻人（20-39岁）和中年人（40-59岁）中，代谢物主要与牙周变量相关，而在老年人（≥60岁）中，牙齿脱落与代谢物水平密切相关。与牙周变量相关的代谢物明显与组织破坏、宿主防御机制和细菌代谢有关。牙周炎与细菌代谢物苯乙酸显著相关，苯乙酸是一种很有前途的牙周炎生物标志物。
唾液生物标志物不仅与口腔疾病有关，而且与远端组织器官的疾病有关，比如乙型肝炎、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、多型胶质母细胞瘤、阿尔茨海默病等均有唾液代谢组学变化。Gilany K等[27]在慢性乙型肝炎患者唾液的代谢组学初步研究中发现一系列代谢产物，包括丙酸、腐胺、醋酸、琥珀酸、酪氨酸、乳酸、丁酸、丙酮酸、4-吡啶氧基和4-羟基苯甲酸,将其相互结合可以准确区分病人和健康人。Assad DX等[28]对唾液代谢组学进行了荟萃分析，在口腔癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和多形性胶质母细胞瘤患者的唾液中发现了140种显著不同的唾液代谢物，大多数都是氨基酸。其中脯氨酸、苏氨酸、组氨酸联合诊断乳腺癌具有良好的敏感性和特异性，胆碱、甜菜碱、哌啶酸、左旋肉碱联合诊断早期口腔癌具有良好的敏感性和特异性。另外，Wijnant K等[29]还通过唾液代谢组学研究发现了45个肥胖相关代谢物和鉴别指纹。
然而，将这些技术应用于临床诊断无疑面临着挑战[14]。例如，代谢产物如缬氨酸、丙氨酸、乳酸、丙酸和丁酸作为疾病指标的特异性值得怀疑。代谢产物如缬氨酸被发现在不同的疾病中上调，包括牙周病[30]和口腔癌[31]。事实上，Sugimoto M等[32]发现唾液中的缬氨酸在乳腺癌和前列腺癌中也增加了，而不仅仅是口腔癌。类似地，丙酸盐在许多不同的疾病中被发现上调，包括阿尔茨海默病[33]、痴呆症[34]、牙周病[35]和龋齿[36]。因此，这些分子可能代表唾液代谢组的非特异性病理变化。此外，一些研究报告了相互矛盾的结果。例如，丁酸盐的浓度随着龋齿的出现而增加或减少[16]。分离的单一代谢物很可能不能对大多数疾病产生足够的诊断特异性，但是多变量分析可以提高准确性。唾液代谢组学研究需面对的另一挑战是研究之间的异质性，样本收集和制备方法、所使用的分析平台和所采用的统计方法存在着相当大的差异。这一点已在最近的口腔癌和牙周病诊断的唾液代谢组学研究中得到证实，研究之间的异质性程度意味着不可能比较研究同一疾病的不同组的结果[37]。为了使生物标记物成为临床上公认的诊断有用的指标，有必要就样本处理等达成共识，并在从事这类项目的不同中心之间对分析设备进行交叉验证。
四、展望与趋势
鉴于唾液的巨大优势，应制定唾液收集、存储和分析疾病特异性生物标志物的标准方案，并分析其与疾病的相关性[4, 38]。唾液研究是一个不断发展的研究领域，仪器和数据分析方法的进步可以帮助开发基于这些分子的前瞻性疾病特异性生物标志物。虽然唾液中检测到的大部分代谢物已经被鉴定出来，但是在解释这些不同代谢物的临床意义方面仍有大量的工作要做。随着代谢组学技术及分析方法的发展，唾液代谢组学未来研究的重点将是确定唾液代谢物的功能作用，并在实现标准化的收集程序的基础上与基因组学、蛋白质组，转录组和微生物组等多维度综合评估分析，从而更加深入彻底地认识口腔及全身系统性疾病。
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