液体活检在泌尿系统肿瘤伴随诊断中的局限性与临床应用前景

陈葳，博士生导师，研究员/主任技师，二级教授。现任西安交通大学第一附属医院检验科主任，兼任中华医学会检验医学分会常务委员、中华医学会医学遗传学分会委员、中国医师协会检验医师分会常委、中国老年保健医学研究会检验医学分会副主任委员、中国老年医学学会检验医学分会常委、陕西省医学会检验医学分会副主任委员、陕西省医学会遗传学会副主任委员、陕西省病原微生物实验室生物安全专家委员会副主任委员。西安市高层次人才，《中华检验医学杂志》通讯编委。主持国家自然科学基金4项，发表SCI收录论文50余篇，其中ESI高被引4篇。

吴文婧，博士，副主任技师。现任西安交通大学第一附属医院检验科血液组组长，主要研究方向为非编码RNA在肿瘤中的功能及机制研究。曾在美国约翰霍普金斯大学医学院进行研究工作。作为项目负责人主持国家自然科学基金、陕西省自然科学基金等4项，获得2017年西安市科协青年人才托举计划资助项目1项。在Gastroenterology、Cancer Letters、Plos One等国内外刊物发表学术论文多篇。现任中国生物化学与分子生物学会临床应用生物化学与分子生物学分会青年委员、中国医药教育协会肺部肿瘤专委会检验分委会委员及中国老年保健医学研究会检验医学分会青年委员。

泌尿系统肿瘤涵盖肾上腺、肾脏、输尿管、膀胱以及尿道的肿瘤，最常见的是膀胱癌、肾癌和前列腺癌，简称“泌尿三癌”。根据世界卫生组织统计，2020年我国“泌尿三癌”的新发病例数超过27万例，同期死亡人数超过13万例。早期肿瘤通过及时发现、及早手术，多数患者的预后较好，如晚期肾癌的5年存活率仅有30%，而早期肾癌5年生存率可达90%，这凸显了早诊、早治的重要性。传统泌尿系统肿瘤的诊断主要依靠影像学、输尿管镜和尿脱落细胞学检查，其敏感度和特异度有限，容易漏诊。多数患者诊断时已到中晚期，生存率低且生活质量差。具有侵袭性和缺乏敏感性和特异性诊断监测技术成为攻克泌尿系统肿瘤的最大难题之一。因此，寻找敏感度高、特异度强的无创或微创便捷的方式，建立快速、简便的早期诊断技术以及早期诊断模型已成为泌尿系统肿瘤诊治的研究重点。

机体免疫逃逸，调控细胞生长与增殖基因变异的持续累积引起机体肿瘤的发生。基于实体肿瘤组织构建的基因图谱揭示了肿瘤的异质性，为疾病的治疗提供了方向，然而组织活检创伤大，重复性差，难以在临床广泛应用。由于肿瘤细胞快速生长导致肿瘤衍生细胞、核酸和囊泡不断释放到体液循环中，因此检测机体体液中肿瘤源性成分，能帮助临床医生重复性并且微创地观察癌症患者疾病的转归，从而实现个体化诊断和治疗，这项技术称之为液体活检技术（liquid biopsy）。

作为体外诊断的一个分支，液体活检就是通过血液或者尿液等对癌症等疾病做出诊断，其优势在于能通过非侵入性取样降低活检的危害，样本具有多样性，肿瘤异质性表征高，肿瘤区域选择偏移小。液体活检可以检测到体液中的任意物质，包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及RNA，细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白质和代谢产物等。液体活检技术凭借其微创、快速与实时监控等优势已成为肿瘤研究领域的新兴技术。液体活检通过检测和分析各种体液（血液、尿液、胸腔积液及腹水等）的肿瘤标志物，为肿瘤的连续精准诊断、靶向治疗和预后提供判断依据。

泌尿系统肿瘤的多发性、高恶性程度以及易复发性是临床治疗的重要障碍。液体活检技术的发展使得泌尿系统肿瘤精准诊治成为可能，并通过实时检测了解患者疾病的进展程度。该文对液体活检技术在泌尿系统肿瘤伴随诊断中的最新应用研究及进展综述如下。

一、临床常用液体活检技术

外泌体、循环肿瘤细胞和游离肿瘤DNA被誉为液体活检的“三驾马车”。通过联合分析，从分子水平检测多种肿瘤信号，有助于精确到具体的基因型或亚型，从而对患者进行个体化诊断和治疗，缩短肿瘤的诊断时间，有利于治疗方案的优化，延长患者的生存期[1]。

1. 外泌体：外泌体是细胞内多囊泡与细胞膜融合后释放到细胞外的约50~150nm的膜性囊泡，可携带蛋白、脂质、DNA和RNA等多种内容物，参与免疫应答、抗原提呈和细胞间通讯等生理病理过程。外泌体通过体液运送至其他部位，引起肿瘤转移或复发。外泌体不仅在靶细胞中发挥作用，还可作为诊断的标志物反映肿瘤病灶的突变情况。除此之外，通过富集分析外泌体还有助于探究机体免疫逃逸机制，设计靶向治疗药物。总之，外泌体技术的应用可为泌尿系统肿瘤的诊断与监测提供更多便捷方法（表1）。

表1. 泌尿系统肿瘤外泌体中富集到的分子及其应用

2. 循环肿瘤细胞：循环肿瘤细胞部分以单个细胞的形式出现在体液中，通过单细胞测序、转录组学、蛋白质组学与代谢组学分析，可为临床提供肿瘤信息。此外，循环肿瘤细胞也可成团存在，包括2个或大于50个循环肿瘤细胞聚集形成的肿瘤栓子，从而更容易引发肿瘤细胞转移到新的宿主部位，利用药物将肿瘤栓子离散，从而减弱肿瘤转移潜能。研究发现，循环肿瘤细胞的存在与高危非肌肉浸润性膀胱癌首次复发的时间以及进展之间存在很强的相关性[8]。

3. 游离肿瘤DNA：ctDNA可反映肿瘤的遗传改变和肿瘤负荷，可进行多基因分析，与常规组织活检比较具有非侵入性、患者依从性好、异质性低、可反复取材等优势，其在靶向药物的选择及伴随诊断中的应用具有很大的优势。在肾细胞癌中，ctDNA可按设定的时间间隔进行常规方法监测肿瘤复发的情况，减少筛查CT扫描带来的潜在危害，包括造影剂肾病和辐射暴露[9]。通过鉴定ctDNA携带的特异性甲基化标志物可实现癌症的诊断和监测，例如通过检测血液中ctDNA谷胱甘肽S转移酶P1（GSTPI）基因启动子的甲基化程度，发现前列腺癌患者中该位点高度甲基化，据此可有效鉴别前列腺癌和前列腺增生[10]。循环肿瘤衍生核酸的下一代测序技术进步有望应对开发安全有效的癌症筛查测试的挑战。

二、液体活检在泌尿系统肿瘤伴随诊断中的应用前景

靶向药物使用过程中实行伴随诊断有助于确保药物的安全性与有效性，是执行"精准医疗"理念的核心步骤之一，因此，伴随诊断在临床肿瘤综合管理中的价值越来越重要。液体活检一方面可直接获得肿瘤基因组信息，指导肿瘤的靶向治疗，全面连续监测，避免肿瘤异质性引起的取样误差[11]；另一方面基因联合筛查提高了肿瘤监测的特异度和敏感度，可实时及时调整治疗方案。随着技术的革新，液体活检将逐渐在肿瘤的诊断、治疗与预后中展示出巨大的潜力。

1. 靶向治疗：针对晚期无法获得组织样本且需要动态监测的患者，通过液体活检实现靶向治疗非常重要。Cheng等[12]发现阻断了循环肿瘤细胞的产生可抑制小鼠淋巴结和远处转移的形成。Annala等[13]提出了对雄激素受体定向治疗耐药性的新基因组驱动因素，表明循环肿瘤DNA测序为测定这些潜在的治疗指导生物标志物提供了一种实用的方法。

2. 预后判定：液体活检检测到一系列新型肿瘤标志物，血清、尿液或组织中游离的mRNA或者miRNA可作为肿瘤预后判定的指标，通过这些指标建立的泌尿系统肿瘤预后模型，可达到判断预后的目的。

3. 分子分型：肿瘤细胞具有无限增殖和能量代谢异常等生物学特点，依据肿瘤细胞区别于正常细胞的功能特性进行CTC分型，有助于鉴定CTC的生物学活性和转归，从而为肿瘤的病情评估和病程监测提供更丰富的信息。CTC分子分型可为全面评估肿瘤状态和肿瘤精准诊疗提供重要的实时信息；基于治疗靶标的CTC分型分析有助于提示药物疗效，从而指导治疗决策，如ARV7（前列腺癌内分泌治疗）、HER-2/EGFR/KRAS（靶向用药）、PD-L1（免疫治疗）等[14]。基于糖代谢标志物（磷酸甘油酸激酶 1/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）的CTC分型在提示前列腺癌远处转移方面具有重要价值，联合高代谢型CTC和tPSA、Gleason评分可有效辅助诊断前列腺癌转移（ROC曲线下面积为0.904）[15]。

三、液体活检在临床患者管理应用中的局限性

尽管目前已发现多种与泌尿系统肿瘤发生、发展及预后相关的生物学标志物，但是由于个体差异、基因突变位点以及疾病分期的不同，使得每个患者的肿瘤标志物具有较大的异质性，因此对疾病状态的评估可靠性不足，同时诊断的灵敏度与特异度也会受到影响，这造成了液体活检在临床上难以广泛应用。仅依靠单因子的预测模型无法完全满足临床诊疗需求，必须多学科结合建立多指标联用的诊断模型，以提高诊断的灵敏度及特异度，对泌尿系统肿瘤建立诊断体系、靶向治疗、预后监测具有重要的意义。此外，对于非侵袭性肿瘤，可能由于CTC或者ctDNA数量有限，造成假阴性或者无法体现患者肿瘤突变的全貌。如何有效富集CTC和ctDNA，并获取患者全部的突变信息，是未来液体活检技术需要发展的方向。目前，液体活检技术尚未完全成熟，尤其是外泌体尚无规范的操作指南，用于临床有一定的风险。因此，CTC用于指导用药、疗效监测、靶向药物伴随诊断及早期辅助诊断作用，ctDNA用于疗效监测、早期辅助诊断及肿瘤进展与不良预后早期预警，现阶段仍仅限于科研探索中。

四、展望

由于肿瘤的特殊性质，实现无创检测与监测，有利于患者伴随诊断，显得尤为重要。但液体活检技术在临床上的广泛应用还有很长的路要探索，确认液体活检的临床有效性和临床实用性；综合分析体液样本，获得多变化参数，全面分析监测患者机体微小的变化，开发新型预测工具，快速采取治疗行动是未来液体活检推进以及发挥潜力的重点。

参考文献

Khan KH, Cunningham D, Werner B, et al. Longitudinal liquid biopsy and mathematical modeling of clonal evolution forecast time to treatment failure in the PROSPECT-C phase II colorectal cancer clinical trial[J]. Cancer Discovery, 2018,8(10):1270-1285. DOI:10.1158/2159-8290.cd-17-0891.

Lin SY, Chang CH, Wu HC, et al. Proteome profiling of urinary exosomes identifies alpha 1-antitrypsin and H2B1K as diagnostic and prognostic biomarkers for urothelial carcinoma[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 344-446. DOI:10.1038/srep 34446.

Santoni G, Morelli MB, Amantini C, et al. Urinary markers in bladder cancer: an update[J]. Front Oncol, 2018, 8: 362. DOI:10.3389/fonc.2018.00362.

Berrondo C, Flax J, Kucherov V, et al. expression of the long non-coding RNA HOTAIR correlates with disease progression in bladder cancer and is contained in bladder cancer patient urinary exosomes[J]. PloS One, 2016, 11(1): e0147236. DOI:10.1371/journal.pone.0147236.

Yazarlou F, Mowla SJ, Oskooei VK, et al. Urine exosome gene expression of cancer-testis antigens for prediction of bladder carcinoma[J]. Cancer Manag Res, 2018, 10: 5373-5381. DOI:10.2147/CMAR.S180389.

Foj L, Ferrer F, Serra M, et al. Exosomal and non-exosomal urinary miRNAs in prostate cancer detection and prognosis[J]. Prostate, 2017, 77(6): 573-583. DOI:10. 1002/pros.23295.

Zhang W, Ni M, Su Y, et al. MicroRNAs in serum exosomes as potential biomarkers in clear-cell renal cell carcinoma[J]. European Urology Focus, 2018, 4(3): 412-419. DOI:10.1016/j.euf.2016.09.007.

Busetto GM, Ferro M, Del Giudice F, et al. The prognostic role of circulating tumor cells (CTC) in high-risk non–muscle-invasive bladder cancer[J]. Clin Genitourinary Cancer, 2017, 15(4): e661-e666. DOI:10.1016/j.clgc.2017.01.011.

Bergerot PG, Hahn AW, Bergerot CD, et al. The role of circulating tumor DNA in renal cell carcinoma[J]. Cur Treat Opt Oncol, 2018, 19(2): 10. DOI:10.1007/s11864-018-0530-4.

Hou GF, Sui Y, An LW. Progress in studies of glutathione S-transferase P1 and prostate cancer[J].National J Androl, 2006, 12(12): 1113-1115.

Lopresti A, Malergue F, Bertucci F, et al. Sensitive and easy screening for circulating tumor cells by flow cytometry[J]. JCI Insight, 2019, 5(14). DOI:10.1172/jci. insight.128180.

Cheng T, Roth B, Choi W, et al. Fibroblast growth factor receptors-1 and -3 play distinct roles in the regulation of bladder cancer growth and metastasis: implications for therapeutic targeting[J]. PloS One, 2013, 8(2): e57284-e. DOI:10.1371/journal. pone.0057284.

Annala M, Vandekerkhove G, Khalaf D, et al. Circulating tumor DNA genomics correlate with resistance to abiraterone and enzalutamide in prostate cancer[J]. Cancer Dis, 2018, 8(4): 444-457. DOI:10.1158/2159-8290.cd- 17-0937.

Association MDGoLMBoCM. Chinese expert consensus on clinical application and laboratory test of circulating tumor cells[J]. Chin J Lab Med, 2021, 44(11): 1008-1020.

Chen J, Cao S, Situ B, et al. metabolic reprogramming-based characterization of circulating tumor cells in prostate cancer[J]. J Exper Clin Cancer Res, 2018, 37(1): 127. DOI:10.1186/s13046-018-0789-0.