【摘要】过去十年为临床微生物学带来了颠覆性的变革。本文探讨了诊断领域的十大变革性创新，不仅包括最先进的技术，还包括分析前和分析后的进步。临床决策支持工具重塑了检验实践，减少了不必要的检测。宽范围聚合酶链式反应和宏基因组测序、全基因组测序、多重分子检测、快速表型敏感性检测、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等创新技术都扩展了我们的诊断手段。基于家庭的(居家)快速检测使诊断检测比以往任何时候都更容易获得。临床医生-实验室接口的改进可实现自动化管理干预和教育。实验室重组和整合正在重塑微生物学领域，为临床微生物实验室的未来带来了机遇和挑战，在此，我们将回顾过去十年的主要创新。
过去十年为临床微生物学带来了颠覆性的变革。本文探讨了诊断领域的十大变革性创新，不仅包括最先进的技术，还包括分析前和分析后的进步（见表1）。临床决策支持工具（CDST）重塑了检验实践，减少了不必要的检测。宽范围聚合酶链式反应（PCR）和宏基因组测序、全基因组测序（WGS）、多重分子检测、快速表型敏感性检测以及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）等创新都扩展了我们的诊断手段。在本文中，我们将这些实验室进展分为分析前、分析中、分析后和其他类别，以反映这些进展如何在临床护理中应用，文中提供了一个时间表来展示这些技术或创新在过去十年中何时出现（见图1）。虽然有些技术是在2013年之前开发的，但这些日期反映了它们出现在主流临床微生物学。
一、检测分析前
1. 临床决策支持工具（CDST）：临床微生物学家很早就知道，分析前往往是产生高质量结果的最重要但却被忽视的因素。例如，强调使用适当的技术进行良好的样本采集，并制定非无菌区进行培养的质量标准。在过去十年中，分析前创新的重点已转向行为经济学，即利用基于自动化系统的CDST推动临床医生在临床检查的早期，更好地利用诊断检测。抗微生物药物管理计划与信息技术人员相结合，在CDST的设计和实施过程中发挥了至关重要的作用。这些新型干预措施的一些实例包括：（1）最佳实践警报（BPAs），以停止对无感染症状的患者进行不必要的诊断检测。例如，在对无症状患者进行尿液检测时触发BPA，可减少尿培养指令和抗生素指令。如果患者不符合艰难梭菌检测标准，则使用电子病历（EMR）硬停止和软停止：＜1岁，48h内服用泻药或24h内排稀便＜3次和临床医生的阳性感知。（2）推广适当检测方法的指南和算法。例如，根据预定义的尿液分析标准，减少不必要的血培养收集或尿培养反射的算法，以减少不必要的尿培养检查和抗生素用药。（3）通过内置的EMR算法，使用限制性或指导性医嘱单来选择适应症，以推动适当的检验选择。例如，要求临床医生在选择尿培养、气管内吸物培养、快速多重呼吸道病原体检测或快速多重脑膜炎检测前，在医嘱单中输入经批准的适应症。（4）更改医嘱单，例如，从标准入院医嘱单中删除尿培养，以防止在低收益情况下过度使用，从而减少了尿培养医嘱单的数量。
面临的挑战：这些干预措施可能无意中减少了适应证情况下的检测，例如，无症状孕妇未获得尿培养。最重要的是，由于过度使用电子提醒扰乱了常规工作流程而导致的“警报疲劳”或者由于CDST建议与医务人员的专业知识或信仰之间的冲突而导致的“医务人员反感”等实施挑战，都会导致临床医生忽视或推翻这些提示。在将这些工具整合到临床实践中时，还额外利用了信息技术人员等资源。
2. 宿主-病原体反应：在过去十年中，宿主对病原体的免疫反应与传染病诊断的整合得到了大幅扩展，两个主要增长领域包括：（1）炎症标志物的监测——最显著的变化是使用降钙素原来指导某些患者群体（危重患者、下呼吸道感染和某些儿科人群）停止抗生素治疗。（2）将细胞计数和分类用于指导样本的充分性和感染的可能性—这一点在尿液分析反射培养中得到了最显著的应用，其中在进行尿培养之前需要显示脓尿（在尿液中通常定义为＞10WBC/hpf），这大大减少了对尿液分离株的不必要检查。使用细胞计数或炎症标志物的类似方法也被用于脑膜炎/脑炎以及人工关节周围感染的检查。虽然检测方法在过去十年中没有发生重大变化，但在过去十年中，这些方法在微生物样本检查中的应用和影响却大大增加，目前已成为护理标准。
面临的挑战：特异性仍然是使用宿主-病原体反应标志物指导治疗的一大局限。C反应蛋白（CRP）和降钙素原等治疗标志物在各种感染和炎症情况下都会升高，尽管它们已长期使用，但经常被误用。加入肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和其他蛋白等其他标志物有助于完善这种方法，但目前仍处于使用初期。另一个挑战是微生物学实验室和监测宿主免疫反应的实验室（例如，CRP、化学中的降钙素原、血液学中的细胞计数）之间缺乏整合，临床实验室部门之间更紧密的互动对于成功利用这些方法至关重要。
二、检测分析中
1. 宽范围的测序：无论是直接从样本还是从培养的分离株中鉴定生物体和确定分类，各种测序方法已成为不可或缺的组成部分。在微生物实验室中，最初的工作是使用传统技术鉴定分离株。不过，如果这些常规方法不成功，实验室可以选择在内部进行测序（如果有能力的话）或将分离株送至参考实验室通过测序进行最终鉴定，测序结果通常被用作物种鉴定的“黄金标准”。尽管宽范围PCR被俗称为“通用PCR”，但它仅限于选择真菌或细菌特有的核糖体亚基，其他宽范围靶标（如rpoB）可用于进一步区分抗酸细菌等群体。一些实验室会要求临床医生选择相关的检测靶点。新鲜冰冻组织通常是首选样本，还可以对福尔马林固定石蜡包埋的组织（FFPE）进行测序，固定过程后，FFPE样本测序的灵敏度可能会受到影响或降低。一般来说，存在病理变化但未显示组织病理学感染证据的样本不太可能通过测序获得阳性结果，因此应尽量避免在这些情况下进行测序。
面临的挑战：大多数临床微生物实验室都无法提供测序服务，而商业化实验室通常价格昂贵，而且整体周转时间在1-4周之间。由于大多数实验室只在传统微生物学方法检测结果为阴性或不确定的情况下才进行测序，因此临床实验室必须有办法保留、跟踪和冷冻已申请测序但初步结果尚未出来的样本（以避免意外丢弃样本）。
与以培养为基础的方法相比，由于样本来源、固定过程和相关组织病理学的不同，其灵敏度存在差异。测序结果必须与临床相关，通常由临床微生物学或传染病临床医生进行，因为可能会发生污染物测序并导致提供者的困惑。
2. 宏基因组下一代测序（mNGS）和全基因组测序（WGS）：近年来，mNGS（一种对临床样本中所有遗传物质进行测序的大规模并行、快速、高通量方法）和WGS（整个生物体基因组测序）的使用已进入主流临床应用，这些技术通常需要大量的生物信息学/计算分析，并且在大型学术医疗中心之外，通常仅限于参考实验室。随着商用软件解决方案的出现，这种情况开始发生改变。
mNGS检测可直接用于原始样本，例如，NGS宏基因组学可用于CSF，并可用于检测RNA病毒。近年来，人们对无需经过培养步骤，直接从血液样本中鉴定微生物越来越感兴趣。直接从血浆中进行的NGS已商业化，它使用游离DNA测序（对释放到血流中的DNA小片段进行测序）来识别血液中和远端感染部位的病原体。这种“液体活检”的新概念越来越受欢迎，尤其是在传统方法检测结果呈阴性或不宜进行侵入性活检的情况下识别病原体。病原体WGS（对纯或高度富集的分离株制剂进行的测序）也正在进入主流临床微生物实验室。WGS最常用于表征细菌样本，例如高分辨率鉴定异常分离株，研究新的抗微生物药物耐药基因以及为了感染控制和流行病学目的评估相关性。尽管真菌WGS仍是一种正在开发的方法，但病毒WGS已成为了解COVID-19大流行期间流行病学和传播的重要工具。
面临的挑战：临床样本测序存在许多挑战，这些挑战限制了这些技术的广泛应用。除了成本高和周转时间不固定外，对检测的病原体和最佳检测时间缺乏了解可能会导致临床医生不下医嘱进行适当的检测（例如，当怀疑某些病毒或寄生虫未被纳入参考NGS数据库时）或错过最佳检测的机会窗口（例如，大多数虫媒病毒感染在感染发生后1-2周内不会在CSF中检测到RNA，从而限制了该检测在后期诊断阶段的灵敏度）。临床医生可能错误地希望使用mNGS测序方法来“排除感染”，尽管缺乏用于该适应证的数据，最重要的是，检测解读和报告仍然是一个关键问题。对临床样本中的多种微生物进行的mNGS检测通常可能包括检出共生或非致病性微生物，这些微生物可能会误导临床医生，并导致本来不会开出的过度治疗或额外诊断。所有病例均应由临床微生物学家或感染性疾病医生进行裁定。对培养分离株的WGS也能产生极其丰富的数据集，然而，WGS数据的实时临床实用性仍是一个亟待开发的领域。挑战包括预测基因组抗生素耐药性结果的表型，以及在作为疫情调查的一部分比较潜在相关菌株的基因组时了解相关性阈值。关于应向临床医生报告哪些基因信息，目前还缺乏明确的指导原则，而关于如何对这些信息采取行动（如果有的话），也几乎没有指导。
3. 多重panels（组合）：多重PCR panels可用于多种样本来源，包括上呼吸道、下呼吸道、血液、粪便、人工关节、腹部和泌尿生殖道。这些panels包括特定感染综合征常见的多种微生物靶标。当医务人员需要分别开医嘱多种检测项目时，这可以减少认知错误，而且其快速的周转时间理论上可以减少广谱抗微生物药物的使用，不过在研究中并未发现这种情况，除非检测与抗微生物药物管理反馈相结合。如果这些检测能在相对较短的周转时间内在所有班次运行，就能实现最大效益，而这可能会给实验室带来严重的后勤问题，特别是在目前人员短缺的情况下。
面临的挑战：使用多重检测panels也有其弊端。其中之一就是检测费用高昂，而保险的承保范围并不一致，这就导致患者的账单或实验室的费用都很高。此外，并非所有临床医生都能理解这些检测panels的所有组成部分，这可能会在没有明确解读指南的情况下造成困惑和不适当的额外检测或治疗。尽管有些公司提供具有扩展选项的分析panels，但通常是不可定制的。过多的靶标可能会导致多个并不总是符合临床表现的阳性靶标，例如，粪便多重检测panels和定植型艰难梭菌或大肠埃希菌（肠道聚集性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌）的检测就缺乏有关治疗或重要性的临床指南。阳性结果可能会让患者和医务人员感到困惑，或导致不必要的治疗。这些检测panels在减少检测周转时间和提高诊断准确性方面具有重要的前景，但它们的成功实施需要在检测适当性和解读方面进行管理整合。
4. 快速表型敏感性：除了分子靶标的快速检测外，另一项进展是引入了快速表型敏感性检测。传统的抗微生物药物敏感性试验（AST）在分离培养微生物后可能需要24-48h才能得出结果。为了加快这一过程，可以直接使用阳性血培养肉汤作为常规方法（纸片扩散技术）的接种物，手动进行快速AST，最多可在6h内得出结果。然而，这种做法十分费力，并未得到广泛应用。模仿标准AST检测结果的新型、劳动强度较低的表型敏感性检测方法已经上市，这是一个快速发展的领域。新的方法包括使用单细胞显微镜检测抗微生物药物诱导的细胞形态变化、评估细胞分裂率、检测基因表达模式或检测挥发性有机化合物。美国有一种商用系统可在阳性血液培养约7h后利用暗视野显微镜下的延时成像技术进行AST检测，监测细菌的形态和动力学变化以确定MIC，其他几个快速AST平台也在开发中。快速AST应与快速鉴定相结合，因为MIC结果及其相关折点只有与生物体ID配对后才能解释，机构可选择将快速ID与快速AST搭配使用的平台，或使用单独的仪器来实现这一目标。
面临的挑战：如果同时采用快速AST和传统AST两种方法，则在实施快速AST方法时需要对快速AST和最终传统AST结果之间的差异进行监控和裁定。医疗机构应考虑如何就快速检测结果向医务人员或监管团队发出警报，特别是如果机构的所有班次都运行快速AST，而这些机构习惯于仅在白班时间接收更新的药敏报告。
5. MALDI-TOF MS：在过去十年中，临床微生物学实验室最具影响力的技术革新可能就是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）的引入，用于鉴定常规临床细菌和真菌分离株。这项技术包括直接从细菌或真菌菌落中进行非靶向蛋白质组光谱分析，并通过不断扩大的高度多样化数据库进行物种级快速鉴定。首台经FDA批准的MALDI-TOF MS仪器于2013年推出，自此以后，这些平台在很大程度上取代了许多耗时耗力的生化方法，而半个多世纪以来，这些方法一直是实验室鉴定的主要方法。除了更准确的物种鉴定外，MALDI-TOF MS还大幅缩短了鉴定周转时间（12-48h）。MALDI-TOF MS的最新进展包括将该方法应用于抗酸细菌、诺卡氏菌和霉菌的鉴定，以及在流行病学调查和抗生素耐药性方面的应用。
面临的挑战：尽管MALDI-TOF MS的影响巨大且试剂成本较低，但其相对较高的资本成本还是减缓了其应用速度，尤其是在较小的实验室。此外，传统生化检测的中断也导致仪器在计划内或计划外的“停机”期间缺乏稳定性。最后，由于该方法易于使用，而且能快速、准确地鉴定菌种，因此报告了一些过去可能不容易报告的微生物，如某些凝固酶阴性葡萄球菌或α-溶血性链球菌。这种“过度报告”可能会给不熟悉这些菌种的临床医生造成困惑，并可能导致不必要的治疗增加。因此，建议在实施过程中纳入实验室和抗微生物药物管理。
6. 居家检测：COVID-19大流行加速了人们对以患者为中心的传染病检测的广泛兴趣，包括由患者采集但由临床实验室分析的样本以及完全基于家庭的检测。患者采集样本已成为诊断性传播感染（包括淋病奈瑟球菌、沙眼衣原体和阴道毛滴虫）的常用方法。在COVID-19大流行时，许多情况下也采用自我采集前鼻孔（AN）样本进行呼吸道病毒检测，但由于担心AN拭子对呼吸道合胞病毒和腺病毒等病毒的敏感性，可能会限制对其他感染的呼吸道自我检测。自采样本的主要优点是方便、隐私和可获取性，对自采集的分析往往支持结果的质量以及对测试接受/利用的积极影响。将自采样本与远程医疗（而非传统的由医务人员提供的门诊服务）联系起来，可提高获取样本的机会以及速度和灵活性。
面临的挑战：围绕无相关远程医疗就诊的居家检测的讨论要复杂得多。在家庭COVID和COVID/流感检测获得紧急使用授权（EUA）之前，FDA批准的完全基于家庭的传染病检测仅限于HIV检测。为了保证试剂盒的稳定性、使用的简便性和清晰的解释，家用检测通常采用抗原侧向层析检测法，将病人的样本加入检测区和对照区，通过出现有色点或线条得出检测结果。一般来说，这些检测方法的灵敏度（通常还有特异性）不如分子检测方法，而且对于什么是足够的灵敏度也存在大量争议。在COVID-19大流行期间，也开发了家用分子检测法，这是未来家用检测的有前景的工具。对居家检测的关注包括检测性能和结果解读、每次检测的潜在成本（通常是自费）、检测组件/过程的质量控制、与护理的联系和纳入EMR，并跟踪任何对公共卫生有益的结果。
在COVID-19大流行期间，随着公众对居家检测和远程医疗的关注，自助式实验室检测和居家检测的问题成为关注的焦点。自采检测的挑战主要涉及样本/运输设备的稳定性/性能和样本采集的质量。隐私、代理、方便和增加检测使用率等优势非常明显，因此，尽管人们对质量和护理联系存在担忧，但预计这些以患者为中心的检测方法在未来将得到推广。
三、检测分析后
临床医生/实验室接口：临床微生物实验室的另一项重大进展是通过推动策略来指导适当的决策，增强了临床医生-实验室接口，同时保持处方医生的自主权。这些新型干预措施的一些例子包括：
1. 框架：将结果与免费文本或教育材料相结合，为结果提供背景。例如，在呼吸道培养物生长出正常共生菌群的情况下，添加解释性指导，注释为“未分离到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌”；在艰难梭菌核酸扩增试验阳性而毒素酶免疫测定试验阴性的情况下，添加提示“考虑定植或早期感染”，增加对在四个血培养瓶之一（两套之一）中生长的凝固酶阴性葡萄球菌的解释指导，如“可能的污染”，并添加了对β-内酰胺酶阴性流感嗜血杆菌或卡他莫拉菌的呼吸道培养的解释评论，指出“可以预见，这种微生物对氨苄西林或阿莫西林敏感。”
2. 级联报告：最初报告窄谱药物，随后仅对耐药菌株的敏感性进行报告。例如仅对头孢曲松敏感的大肠埃希菌和克雷伯菌报告头孢曲松，对头孢唑林敏感的革兰阴性微生物报告头孢唑林。这些干预措施的目的通常是减少美罗培南等广谱药物或艰难梭菌感染或其他抗生素相关不良事件高风险抗生素（如氟喹诺酮类）的使用。
3. 选择性报告：根据预先确定的标准（即广谱抗微生物药物和高药物不良事件）限制某些抗微生物药物敏感性结果的报告。例如，在所有感染部位，当革兰阴性药敏检测结果显示对其他药物敏感时，抑制环丙沙星对肠杆菌的药敏性；或者最极端的情况是，不报告未留置导尿管的住院患者的尿培养结果，而要求临床医生在担心真实感染时打电话给临床微生物实验室询问结果。
4. 结果审查和反馈：血液培养快速诊断结果报告时，抗微生物药物监管人员可提供实时决策支持，在医疗决策时协助解释。已有针对葡萄球菌血流感染（BSI）、革兰氏阴性BSI和所有BSI的研究发表。众所周知，这些干预措施可以改善患者的治疗效果，而且具有成本效益。
面临的挑战：虽然这些引导策略的目的是改善诊断流程，促使及时采取行动，但只有有限的证据表明它们能减少抗微生物药物的使用。更规范的干预措施可能会限制临床医生的投入，导致漏诊。
四、其他
实验室整合：医疗系统整合是近年来影响临床实验室的一个日益增长的趋势，包括检验的各个阶段。实验室整合随着大型商业实验室的发展而凸显。随着医院实验室从收入中心转向成本中心，这些商业实验室越来越多地寻求收购医院实验室。一些检验医学部门则另辟蹊径，在其不断发展壮大的医疗系统内整合各种检验项目和功能。这种解决方案通常需要一个中央实验室承担更大量的检验工作，使医疗系统能够将资源集中在一个地方，用于本报告前面提到的最新技术和进步，这样就可以建立一个具有成本效益的机制，使网络中规模较小的医院也能获得质量改进。
因此，整合既依赖于相关进步，又促进了相关进步，一个典型的例子是全实验室自动化（TLA）。TLA对微生物实验室的影响尤为显著，因为这些实验室传统上一直保持着高度复杂、手工操作和时间密集型的检验菜单。因此，随着合格技术人员队伍的不断缩小，TLA可能使医疗系统能够24 h持续为越来越多的患者提供这种检测，但目前仍缺乏对自动化实验室的结果进行稳健比较的文献。整合为此类活动的协调和标准化提供了机会，也为整个网络最佳实践的遵守、报告和周转时间提供了机会，同样，TLA也可通过平板远程可视化等技术促进结果的获取。
面临的挑战：实验室整合的一个主要缺点是人员无法进入实验室，这导致两者之间的脱离，并阻碍了抗微生物药物管理和感染预防政策制定所需的教育、咨询和密切参与。非现场集中化可能会导致延误或影响医疗质量，例如，血培养孵育和检测是一个高度复杂和资源密集型的过程，因此越来越有针对性地进行集中。虽然指南建议，必须在采集后两小时内将样本放入孵育系统，以防止出现假阴性结果，但在将样本运送至集中地点时，通常会出现显著延误。虽然越来越多的技术可以减轻孵育延迟的影响，但对于血培养而言，周转时间仍然是最重要的。在实验室合并的整个过程中，医疗主管和行政领导层必须共同努力，在财务考虑和患者安全之间保持适当的平衡。
五、结论
本文总结了过去十年在临床微生物学领域取得的重大进展（见表1），每个抗微生物药物管理人员和感染预防从业者都应该知道。为了证明将这些新的微生物学进展纳入临床实践的成本合理，临床医生有必要适当地使用这些技术。例如，制定针对各机构的指南将是支持这些关键诊断和抗微生物药物管理举措的一种方式。这需要与主要利益相关方（包括临床微生物学家、传染病专家、抗微生物药物管理人员、感染预防人员、医院医生、初级保健医师和医疗保健信息技术团队）协同合作，采取高度协作和跨学科的方法。
编译节选自：Antimicrob Steward Healthc Epidemiol. 2024 Jan 25; 4(1): e8.