肿瘤细胞尤其具有侵略性，我们了解这一特点已经超过100年了。具有治疗抵抗特性的原发脑瘤具有多细胞扩展的迹象。R.Virchow准确地将其描述为“神经胶质瘤硬质”（1863-1865），T.Simon则称之为“蜘蛛型细胞神经胶质瘤”（1874）。不久以后，该肿瘤具有“星形细胞”（即像星星一样的形状）形态学得到明确，于是产生了“星形细胞瘤”这一术语。这些反应性神经胶质和星形肿瘤细胞内星形病变在薄切片如正常脑神经元内出现的范围比扩展期广，也比扩展期短。但是，很早就有星形细胞瘤“纤维性”特点的报告，1926年Bailey和Cushing首先报告了星形细胞瘤的纤维性特点。但是星形细胞瘤形态学症候的生物学基础直到现在还未得到更多的关注。
在小鼠头盖骨上打开一个长期的观察窗口，通过双光子显微镜进行长期观察，接着将取自患者的原发神经胶质瘤细胞系植入小鼠大脑并使其增殖，严格控制非分化期（茎状）增殖条件，通过2维或多维观察，我们就有可能增进对这些肿瘤的了解。通过空间3维观察有助于发现超长多血症（高达500um）以及神经胶质瘤（IV期星形细胞瘤）细胞形成的非常薄的膜突起（1-2um厚），以及侵入阶段部分侵入正常大脑和部分单一肿瘤细胞与多细胞网络之间产生连接。第4维时间，有助于进一步描述这些膜突起的特点。通过数分钟至数月（多达一年）的时间对明显肿瘤区域的单一肿瘤细胞进行监视，膜突起用于不断扫描整个大脑，细胞核通过微管转移到更远区域进行定殖，并最终形成有助于神经胶质瘤细胞抵抗放射疗法的相互连接的多细胞网络的现象得到明确。
在这篇评论文章中，我们侧重于当前关于这些膜突起的概念并讨论了其临床意义：这一发现将帮助我们理解一些神经胶质瘤临床病程的差异，在未来开发新疗法，以及有助于将已经分级的患者进行再分级。
肿瘤微管的特点：生物作用和与已知细胞扩展的关系
目前已发现肿瘤微管（TM）有2种功能性生物作用：（i）是神经胶质瘤细胞亲入和增殖的主要结构，使其在脑部有效定殖；（ii）是单一神经胶质瘤细胞与大型合胞体连接的途径，生成功能性治疗抵抗网络。此时，尚不清楚是只存在一种“类型”的TM还是至少有两种不同类型的TM发挥着基本生物功能。相关神经生长蛋白43（GAP-43）似乎对所有功能已知的TM很重要。与此相反，间隙连接蛋白43（Cx43；不可与GAP-43混淆），经常存在于TM及其交叉点内，将肿瘤细胞与功能性多核体相连接，但对侵袭性TM的出现和功能影响不明显。这就可能解释与Cx43有关的不同种类胶质瘤进展发挥不同功能的原因。我们了解到分子在神经胶质瘤的TM内会发挥哪些不同的生物功能。
原则上，神经胶质瘤TM的发现支持了肿瘤作为劫持正常发展的生物体密码指令序列来进行成功增殖、与宿主相互作用并有对其不利的事件进行抵抗功能的类有机体的看法，这一看法越来越得到人们认同。根据这一观点，GAP-43同时在轴突增殖视锥细胞和正在生长的TM类生长锥顶端高度表达。不仅如此，它促使神经元祖细胞和依靠TM的星形细胞瘤细胞迁移。最后，GAP-43似乎是导致长膜扩展基础细胞指令序列的支配性调控因子：GAP-43过表达在神经元甚至非神经元细胞内膜微管生长充分之前已经被描述。
在发育阶段，侵袭性细胞迁移依靠长细胞表达扮演着具有引导作用的“探路者”的角色。这似乎也适用于脑发育阶段的神经元迁移。但显然，这些发现与我们先前在小鼠脑部的星形细胞瘤进展期间TM的发现非常类似。不仅如此，非常长的细胞表达及其在细胞间连接过程中发挥的作用之前已经引起了研究者的注意。在生长发育阶段，果蝇首先出现了细胞间膜微管，这似乎与干细胞信号传导有关。同样，在成人细胞类型中，膜微管也在细胞间耦合时发挥作用，包括肿瘤细胞。这些膜微管有很多名称，包括膜纳米管（MN），隧道微管以及cytoneme（细胞长管）。但是哺乳动物组织和肿瘤生物学的膜微管连接决定性功能仍是一个未解决的问题。
尽管TM与先前描述的MN有很多相似点，但是也有很多不同点（表1），这些独有的特点引导我们为胶质瘤细胞膜扩展提出新的术语“肿瘤微管”。这不排除体外肿瘤细胞MN能成为体内TM模型，尺寸的生长、细胞间连接性范围和功能的增长可以有更长的时间间隔。不仅如此，未来的研究将揭示其他肿瘤有机体CNS内外是否会发现这些膜微管，加深我们对其独特的细胞学特征的理解，并将对术语定义提供支持。但目前我们将“TM”作为工作术语。
1p/19q共丢失对治疗效果更好原因的可能的解释
神经肿瘤科存在一个悬而未决的问题是，为什么患者会患有1p/19q共丢失胶质瘤，即少突神经胶质瘤（根据世界卫生组织即将明确的定义），与患有1p/19q非共丢失肿瘤即星形细胞瘤的患者相比，这种疾病病因大不相同。很明显不是单一的基因而很有可能是与2个染色体上的多种因素联合作用有关，因为仅1p或19q的丢失未发现与延长的存活期有关。根据最近的发现共丢失与非共丢失胶质瘤有频繁的分子变化如异柠檬酸脱氢酶（IDH）1和2基因突变，这个问题变得更加有趣。但是1p/19q共丢失定义了一项独有的清晰的分子亚组并与放化疗高度响应性和肿瘤细胞凋亡有关。很明显对于极大比例的患者而言，扩散的星形细胞瘤仍是一种不可治愈肿瘤，这包括那些罹患IDH突变肿瘤的患者。这与1p/19q共丢失形成鲜明对照，通常为IDH突变少突神经胶质瘤，从长远看，2项3期研究的二级分析（随访中值时间为135-140个月）显示了相当大数量的长期存活者，这些患者在初级护理环境中接受放化疗联合疗法时存活率达到了40%-50%。最重要的是，另一项分析揭示与IDH突变的非共丢失胶质瘤相比，1p/19q共丢失仍然延长了存活期（在初级护理环境中联合接受放化疗总存活期14.7年 vs 5.5年）。这些而数据支持了1p/19q共丢失的预后重要性，独立于IDH突变同时有利于预测IDH突变。
我们近期的研究证明（1）1p/19q非共丢失患者的胶质瘤有大量的细胞间长TM，但1p/19q共丢失的患者却没有；（2）使用WHO分级，TM长度增加；（3）癌症基因组Atlas数据库的250组人体胶质瘤RNA序列基因表达数据可以用于检测1p/19q非共丢失胶质瘤相对较高表达的重要分子途径，这包括间隙连接蛋白Cx43（非共丢失肿瘤表达较高的前100个基因），而且还能检测促使神经突形成和类神经突膜突起扩展核心途径，促使GAO-43表达的核心神经营养因子同时位于染色体部分1p和19q。
这些数据和TM在治疗抵抗中发挥的作用一起（见下一节）为胶质瘤1p/19q状态相关的不同点提供了新的解释。但是它完全不能解释相当多数量的胶质瘤1p/19q共丢失的原因；人们会在肿瘤形成时考虑让肿瘤得利的未知促进作用和/或导致共丢失的不平衡易位IDH突变发挥的促进作用。患者组织内TM与1p/19q状态之间的强大连接是否限制在不能治愈的胶质瘤内也不明确；目前只有那些经过了分析。最后，TM是否能在除1p/19q共丢失以外的胶质瘤类型（也就是室管膜瘤、神经节神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤）内被发现尚未可知。
肿瘤微管连接性作为原发和适应性抵抗的细胞因素
在先前的段落中我们讨论了TM是1p/19q非共缺失胶质瘤的特征，TM将单一肿瘤与其他肿瘤连在一起，但是至少在初级护理环境中，TM在1p/19q共丢失肿瘤中却大量减少。这首先表明TM和治疗抵抗有关。为了更好地理解TM在肿瘤完整性和抵抗作用中发挥的作用，我们利用独立的星形细胞瘤细胞显示显著的异质性：肿瘤进展的TM连接的细胞略有增多，人体和小鼠星形细胞瘤的实体部分（40%-60%）仍未连接。实际上，小鼠体内的TM连接的星形细胞瘤能在接受放疗后免疫细胞凋亡，临近连接的肿瘤细胞大量死亡。不仅如此，当功能性TM构造被GAP-43抑制时，星形细胞瘤的辐射抵抗大幅下降；但是这可能是GAP-43功能与TM构造无关的缘故。最后体内实验性星形细胞瘤内，TM连接性和功能性在放疗后增强。显然TM连接的单独星形细胞瘤肿瘤细胞网络通常在被微型激光束消灭后由依靠TM修复响应取代；当肿瘤细胞不是被TM彼此连接时，这种现象很少被观测到（25%）。当较大的脑区被光损伤时，可以观测到类似的机制（图1）。联系这些发现我们可以知道TM介导的网络连接性对在肿瘤细胞的治疗抵抗性和维持肿瘤机体细胞网络完整性方面发挥着重要作用。未来的研究应该侧重于应用其他标准胶质瘤疗法时，是否涉及TM的“保护和修复”功能。
图1. 损伤修复中的TM。对小鼠脑部100X100um（虚线框）亚区进行高密度激光扫描产生光损伤。该脑区广泛被被单一恶性胶质瘤侵袭，可以看到又细又长的TM。该亚区被光损伤后，临近恶性胶质瘤受到TM庇护，这些新延长的富肌动蛋白过程出现在受损区域（箭头所指区域），该区域迅速被齿状包被的肿瘤细胞占据。注意随着时间的流逝TM总量增加。黄色，LifeACt-YFP（一种体内肌动蛋白标志物），表达原发恶性胶质瘤细胞。蓝色，被注入的荧光右旋糖酐标记的脑薄壁组织微脉管。图像是由体内双光子显微镜经长期头盖骨窗口拍摄的。
为了探索TM介导细胞毒性防护的潜在基质，我们在放疗前使用比率计钙指标测量了星形细胞瘤细胞基础细胞内钙水平。基础钙水平与未受辐射的细胞持平，同时与放疗期间TM连接的细胞持平，但是放疗期间未连接的细胞内钙水平出现较高的变化。细胞内钙水平上升需要放疗诱导细胞毒性，即使是小幅的钙水平升高也与固有胶质瘤细胞凋亡有关。因此，可以推测细胞间TM可以作为单独细胞在较大网络内分散小分子如钙分子的方法，以达到不致命的目的。
显然，间隙连接蛋白CX43也在良性星形细胞内高度表达，将它们连接到一个功能性多细胞网络。很明显CX43间隙连接的连接性使它们抵抗氧化应激，这与我们的星形细胞瘤数据类似。正常脑星形胶质细胞也可以出现MN，这需要p53活化。星形细胞对化疗的抵抗尤其强大，先前已经描述过它甚至可以连接黑素瘤细胞并通过间隙连接保护其免受化疗伤害，正如我们提到的星形细胞瘤一样，在发生细胞毒素应激时，达到更好的细胞自动调节。最近一项研究发现了另一种星形胶质细胞可以保护脑转移性肿瘤细胞的机制：通过磷酸酶和出现在星形细胞外来自体内出现的PTEN下降调节miRNA导致的张力蛋白同系物损失（PTEN）。结合已知的胶质瘤PTEN在化疗抵抗中发生损失的作用以及miRNA可以经由间隙连接在胶质瘤内转移的事实，因此，通过在连接的细胞内协调基因表达，胶质瘤细胞自身是否可以经由TM相关间隙连接通过交换小型无机分子如钙分子和miRNA来自我保护这一问题浮现出来。
肿瘤微管靶向疗法发展的潜在途径
考虑描述TM的形态学和功能时，未来有多种方法可以用于削弱这些特点进行新型抗癌疗法研究。图2是六种我们认为可以用于靶定TM完整性和功能性有前景的方法。这些方法有实验数据支持的原则有效性，但未来的研究会出现更多有前途的治疗方案。
图2. 胶质瘤细胞TM功能和潜在靶定方法原理图
（1）我们证明星形细胞瘤细胞利用TM彼此进行长距离联系，这包括密集肿瘤细胞内的细胞，还包括深入正常脑实质内的细胞，因此一个胶质瘤通过连接更固定和广泛的区域来形成大型功能性多核体。该肿瘤细胞通过频繁运行与大型肿瘤区域间的细胞间钙波（ICW）彼此联系。ICW可以调整多细胞组织内单一细胞的活性，由此创造联系性功能性网络。这包括CNS生长期间正常大脑的星形胶质细胞、神经元和放射状胶质细胞。但是星形细胞瘤细胞利用所有主要已知策略进行TM介导ICW联系（三磷酸肌醇IP3）通过间隙连接和细胞外ATP迁移，在这些大脑区域主要利用ATP共记录的正常脑星形细胞；因此有机会UI特定肿瘤进行靶定。但是需要考虑间隙连接的多重生理功能。间隙连接抑制药物（包括一些国家用于治疗胃溃疡的生胃酮，在我们的模型中显示对星形细胞瘤ICW具有很强的抑制效果）。其他ICE抑制剂则扩散分子（IP3，ATP受体），而且其他种类的钙拮抗剂则可作为备选药物。但是考虑到间隙连接蛋白发挥的重要生理作用，一种特别有效的Cx43抑制剂最可能引起副作用。其他连接蛋白具有适于含氧量较低的星形细胞瘤胞核的潜在能力，如Cx46，如果需要开发特异性抑制剂们则可以考虑Cx46。
（2）间隙连接抑制可能会妨碍肿瘤网络间TM连接的细胞内环境稳定，从而使胶质瘤细胞更易受到损害。我们确认了星形细胞瘤细胞之间不同的间隙连接渗透性分子可以通过其TM交换，但是不能通过间隙连接的大型分子（如红绿荧光水母蛋白）不能被交换。表2给出了原则上可以通过间隙连接的分子和离子概述。如上文说述，间隙连接渗透性钙离子交换有可能促使TM连接的肿瘤细胞抗放射性表型的出现。根据这一点，在我们的模型中GAP-43缺陷功能性TM抑制剂不仅能大幅下调Cx43间隙连接蛋白，还可以显著增强放射响应。因此，间隙连接抑制应该作为放疗致敏剂与其他细胞毒素剂一起进行着重研究。
表2. 可以进行间隙连接渗透并原则上可以在TM连接的胶质瘤细胞间进行交换的分子
（3）在我们的小鼠星形细胞瘤模型中，GAP-43缺陷减少肿瘤侵袭、增殖、互联，明显减弱肿瘤放疗抵抗，抑制功能性TM构造。如前所述，在早期神经元生长的过程中，1p/19q非共丢失星形细胞瘤涉及的途径活化模式很明显。神经元生长时，这些途径促使神经突出现增生，导致神经元出现轴突和树突，它们在成人大脑中的重要性较低。这适用于GAP-43（但是直到成年，仍与非经验依赖性可塑性）和其他潜在神经形成途径，使它们成为药物开发的理想原理标靶。小分子抑制剂的筛查方法和基因疗法也应予以考虑。
（4）TM有明显的形态学，但是许多其他结构性特点与人体正常细胞相同，如高肌动蛋白水平和强细胞运动机制。因此，不对其结构进行直接打击，干扰GAP-43（以及其他可能导致神经突增生的蛋白）不仅会抑制TM形成，还能破坏其稳定性，但这种方法是否更有前景目前尚未可知。此外，应该研究对TM至关重要并支持其稳定性和连接性的细胞粘附分子；细胞外作用位置使它们成为可能的药物标靶。
（5）TM内的高量线粒体和其他细胞器，以及TM内间接核分裂后有效快速的胞核迁移使人们惊讶于TM的运动机制具有如此特殊的特点，因此该特点可以在考虑正常细胞功能后进行靶定。但目前这种方法是否有前景也未可知。
（6）也许应该考虑一种完全不同的方法：不攻击TM，但是削弱他们，因此“劫持”网络连接性并在本地远端肿瘤细胞内散布或CSF注入毒性分子。但是这些分子需要能够进行间隙连接渗透。表2也罗列了理论上可以进行间隙连接渗透的药剂。
肿瘤微管状态能作为预测性生物标志物？
胶质瘤治疗中，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（甲基鸟嘌呤甲基转移酶（MGMT））启动子状态已经可以作为预测替莫唑胺化疗响应可能性的良好生物标志物。临床缺乏有用的放疗预测性生物标志物。全世界（神经）病理科都利用IDH1-R132H突变特异抗体，我们证明胶质瘤细胞衍生的膜扩展表明可以从患者身上切除的胶质瘤组织标准石蜡切片上很容易地检测TM。技术层面上，更具侵袭性的肿瘤部分允许进行最大长度的TM测量，该值明显与1p/19q状态和肿瘤分期有关。但是，1p/19q共丢失和非共丢失胶质瘤存在大量重叠，尤其是在标准薄片上50-100um最大TM长度中点值时重叠最严重。研究切除的神经胶质瘤中最大TM长度与随后的化疗响应有无关系非常有意义，因此应该在临床试验中对该预测性标志物进行前瞻性测试。
非常重要的是，明确检测富有长纤丝脑实质肿瘤衍生纤维结构的能力有助于可靠地对标准切片中的TM长度进行测量。除了IDH1-R132H特异性抗体外，并无其他有建设性的选择能达到这目的；该抗体对BRAFV600E突变具有特异性，似乎是一种可行的方法。但是突变在扩散的胶质瘤中很少见，因此能清楚着色并测量肿瘤细胞衍生TM的新方法得到批准并广泛用于原发恶性胶质瘤的分析。
结 论
最近星形细胞瘤包括恶性胶质瘤脑部定殖和互相连接TM的发现可能已经改变了我们对这些疾病本质的理解。不仅如此，这激发出我们通过多种不同于既定疗法和现有研究的方式处理治疗抵抗性胶质瘤的想象力。未来这些希望是否能转化为可行的耐受良好的脑部渗透疗法，并能在胶质瘤患者治疗方面的效果，尚不得而知。此时此刻，联合TM靶定疗法和现有治疗方法如放射疗法貌似最有前景。为了靶定TM，应该优先考虑抑制对成人大脑不重要的但有助于TM形成的神经发育途径的方法。
（摘自Neuro-Oncology，版权归其所有，仅供内部学习）
编译：张凯
审校：王小茜