作者：赵建玉 周倩倩 鲁辛辛
【摘要】通过宏基因组下一代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技术确认病原微生物已成为新发突发、罕见及常规检测阴性感染性或传染性疾病诊断的重要手段，这项技术改变了临床对感染性疾病的思维模式，成为实施精准诊疗的重要驱动力。本文就mNGS临床应用面临的问题与挑战以及未来发展趋势进行探讨。
【关键词】mNGS，病原微生物，问题与挑战
1998年首次从一份土壤标本中获取了所有微生物的基因组信息，由此提出了宏基因组的概念[1]。2000年，宏基因组学的应用开始从环境拓展到临床，临床宏基因组学（Clinical metagenomics，CMg）以获取临床相关的微生物信息为目的，对临床标本中所有的核酸序列进行测序分析[2]，其常用技术为mNGS。mNGS属于二代测序技术，无需培养、无偏好性检测病原，获取病原体的物种分类、血清型、耐药及毒力等一系列生物信息[3]。该技术克服了一代测序通量低的缺陷，一次能对几十万到几百万条DNA序列测序，但获得单条序列的长度仅250～500bp，准确度不如一代测序（一代测序一次只能获得一条长度在700～1000个碱基的序列）。利用mNGS技术已成功发现了SARS冠状病毒，识别了导致癌症的突变基因图谱，以及对人体不同部位的微生物组学进行了分析。近十年来，现有测序仪器的激增和测序成本的指数级下降推动了NGS技术的临床开展[4]。2019年底，mNGS在新型冠状病毒肺炎疫情中发挥了重要作用，成为此次疫情病原体快速鉴定的关键技术。相较于2003年SARS鉴定耗时5月余[5]、2013年H7N9鉴定耗时1月余[6]，新型冠状病毒基因组的分析和鉴定仅用了五天[7]。新型冠状病毒的早期发现为本次疫情防控争取了时间，为后续的临床诊断和治疗明确了方向。尽管传统病原学诊断不断发展，仍有近50%的感染病原不明。mNGS测序技术的出现，为不明原因的疑难重症、新发、突发病原体的鉴定提供了新的选择，成为临床实验室的重要技术补充。虽然mNGS在感染性疾病的诊断中凸显出巨大优势与潜力，但该技术从研究走向临床也面临诸多挑战，尤其在结果解读方面，影响因素众多，在进行结果判读时，考虑技术缺陷并密切结合临床至关重要。
一、mNGS的临床应用
1. 感染性疾病的诊断与鉴别诊断
传统微生物鉴定方法（培养、抗原、抗体、PCR）一次只能检测一种或有限的病原体，mNGS针对临床标本中所有核酸物质，包括DNA和/或RNA，无偏倚检测病毒、细菌、真菌和寄生虫等[8]，主要用于中枢神经系统、呼吸系统和循环系统感染性疾病的诊断与鉴别诊断[9]。此外，对测序数据进行二次分析还可获得更多遗传信息，如系统发育谱系[10, 11]、耐药性预测及确定耐药基因等[12]。
传统感染性疾病的诊疗模式为医生拟诊，然后进行一系列检查找出病原微生物，但是罕见、新发（如SARS-COV-2病毒）或突发感染性疾病往往超出临床医生预期而漏诊或误诊，花费巨大，愈后不良，此时mNGS显示了成本和技术优势。若果断进行mNGS无选择性查找病原微生物，将对疑难、免疫功能低下非常见病原微生物识别以及非感染性疾病的排除诊断具有决定性意义[13]。有研究表明自身免疫性脑炎与感染性脑炎二者发病率相当[14]，mNGS可以有效的帮助医生排除活动性中枢神经系统感染，使自身免疫性脑炎患者更早的接受经验性免疫抑制的治疗[15, 16]。美国的一项研究分析结果显示，相对于mNGS而言，常规脑脊液（CSF）检测仅具有67.5％的阳性一致率，mNGS使神经系统感染的检出率提高22％[10]。最近报道，利用mNGS从一位脑炎患者的CSF中快速鉴定出一种新型经蜱传播的Powassan病毒[17]。mNGS不仅可以发现新的病原体，还可识别出病原体与疾病之间的新型因果关系，如2016年一项研究通过mNGS证实作为皮肤正常菌群的痤疮丙酸杆菌却与慢性脑膜炎相关[18]。另外，mNGS在某些缺乏特异性的病原体感染及混合感染的诊断中同样具有优势，如结核性肝脓肿[19]及免疫缺陷患者的混合感染[20]等。
2. 微生物种群与疾病的关系
许多研究人员利用mNGS对微生物种群及其可能参与的急慢性病进行研讨[21, 22]。但是否可用于疾病的诊疗，尚未得到临床验证。长期暴露于抗生素或近期行胃肠道手术的免疫功能低下的患者因肠道微生物菌群失调易感染艰难梭菌[23]。粪便移植治疗艰难梭菌感染具有80~90%的疗效，目前用于微生物种群分析的mNGS技术已促进了益生菌的开发[24]。Ley等人利用mNGS研究孕妇粪便，发现在怀孕前三个月和后三个月里，其肠道内致病菌数急剧上升，有益细菌数明显降低，炎性标志物也增加[25]。因此，围孕期给母体补充适量益生菌，不仅可以改变母体消化及免疫功能，也有利于胎儿肠道有益菌生长及肠道免疫系统的成熟。同时，越来越多的研究显示微生物种群组成不平衡与各种疾病相关，如克罗恩病[26][32]、肠易激综合征[27][31]、息肉病或结直肠癌[28]、2型糖尿病[29, 30]、坏死性小肠结肠炎[31]、肥胖症[32]和孤独症[33]等。宏基因组学的发展对研究微生物群落与人体健康的关系具有十分重大的意义，我们可以扩展到呼吸道、泌尿生殖道、口腔、皮肤，甚至治疗不同阶段种群变化对疾病愈后的判断，即mNGS的预测功能。
微生物种群的另一个潜在应用是分析细菌多样性以鉴别感染性与非感染性疾病，有研究表明呼吸道感染的患者种群多样性显著降低[34]。有研究利用mNGS技术发现健康人、肺移植患者及HIV阳性患者呼吸道真菌种群分布存在差异，免疫缺陷患者呼吸道中，念珠菌、隐球菌及曲霉菌更为常见；念珠菌含量丰富的口咽菌群富含缓症链球菌，这是一种与病原微生物生物膜相关的种群模式。因此，利用mNGS可以更准确地描述人类呼吸道中的病原菌群落特征[35]。
3. 转录组学分析的优势
RNA的表达通常与微生物转录活性有关，检测RNA可能有助于区分感染与定植[34]或病原微生物的存活与死亡[36]。检测病原体RNA的同时，分析人类宿主的转录组学可增强对宿主-微生物相互作用的认识，尤其在病原体短暂存在时可根据人类特异性宿主免疫反应间接诊断，如莱姆病[37]或某些虫媒病毒感染等。莱姆病主要通过检测血清中抗伯氏疏螺旋体抗体进行诊断，抗体的敏感性随感染时间延长而增加，而患病早期可能呈假阴性。有研究发现莱姆病早期的基因表达特征不同于其他急性感染性疾病，如Toll样受体信号转导显著上调，并且在感染后至少持续3周[38]。通过mNGS对宿主外周血RNA进行转录组学分析，筛选出基于宿主的基因生物标记物，可能会提高莱姆病“窗口期”检测的敏感性。还可根据宿主RNA对活动性结核病做出预测，一项前瞻性研究对感染了结核分枝杆菌的青少年队列随访2年，每6个月采集一次血液样本，最终从46名发展为活动性肺结核患者和107例非活动性对照组的宿主RNA表达谱中确定了16个风险评估基因标记，这些标记在一年前预测活动性结核病的敏感性为66.1%，特异性为80.6%[39]。此外，葡萄球菌、念珠菌、流感病毒感染的特异性宿主转录组学特征也已得到研究[40-42]，这些RNA标记物的发现将有助于深入了解微生物的致病机制。区分感染性与非感染性疾病可能是病原微生物特异性宿主转录组学分析的另一个发展方向，一项研究表明，同时评估呼吸道病原体、呼吸道微生物种群和宿主转录组可使下呼吸道感染的阴性预测值达到100%[34]。呼吸道标本微生物复杂多样，宿主转录组学将有助于感染的诊断与鉴别诊断。
二、影响结果判读的问题与挑战
受测序灵敏度、取样及病程变化、实验室检测能力及生物信息学分析水平的影响，mNGS阳性或阴性结果不能作为临床诊疗决策的唯一依据，即使无菌部位标本的mNGS结果也需结合临床进行综合判断。mNGS测序结果判读应结合临床与微生物专业知识。
1. 测序策略
目前，尚没有针对mNGS的标准化程序。mNGS的测序策略包括DNA和/或RNA测序，不同的测序策略会影响某些病原体的检测能力，进而影响结果准确性。因此，在拟诊的基础上，深入了解各种测序策略的适应症对临床医生选择合适的检测项目具有重要意义。DNA测序，将检测除RNA病毒以外的病原体。而RNA测序是检测RNA病毒所必需的，并且可对转录组学及宿主特异性免疫反应做进一步分析，此外，RNA测序还可反映致病菌的转录活性。因此，若临床已排除病毒感染，可直接进行DNA测序。当怀疑病毒感染，尤其是呼吸道、血液标本、CSF，或临床表现复杂，无特定怀疑方向时，应同时进行DNA和RNA测序。如果仅进行DNA测序可能会造成假阴性。
2. 标本质量
（1）采样时机：通常认为症状超过1个月的亚急性和慢性感染者可在较长时间内获取含有微生物核酸的标本，如感染钩端螺旋体四个月[43]、囊虫病一年[44]mNGS检测仍可阳性。但急性病毒感染，如西尼罗河病毒，仅在发病的最初几个小时或几天出现在CSF中[45]，错过急性期可能造成假阴性。此外，采样前抗菌药物使用也可造成假阴性。
（2）标本采集：标本采集应严格按照无菌操作防止污染造成假阳性结果，如腰椎穿刺获得的CSF标本、持针器肘静脉采集的血液标本可能会受到正常皮肤微生物的污染[46]，溶血性CSF使RNA病毒检测的敏感性降低[47]。理想情况下应优先选择经过验证的、不含DNA/RNA的采集容器，严格遵守标本采集原则对降低污染风险至关重要[48]。
（3）转运和储存：标本的转运和存储同样会影响检测结果，血清或CSF标本在室温或4℃保存数天，尤其是RNA降解而使mNGS产生假阴性结果。EDTA因螯合酶活性所需的金属离子，从而抑制核酸酶和蛋白酶，使核酸稳定性增强，因此应尽量新鲜标本立即送检，如果需延迟处理，EDTA血液或血浆样品比血清样品更可取[49]。
3. 核酸提取方法
mNGS技术的准确性不仅依赖标本中微生物的核酸质量及含量，也依赖于不同类别微生物核酸的提取效率。由于不同微生物类别本身结构差别，其核酸释放效率差异明显，尤其是真菌、分枝杆菌细胞壁较厚，如果不使用特殊的破壁处理方法，核酸提取效率低而产生假阴性结果。某些菌株在使用试剂盒，如MolYsis预处理过程中可能会使DNA降解[50]。
4. 核酸含量
mNGS从根本上讲是一种直接核酸检测方法，通过回收基因组DNA或RNA来鉴定病原微生物，如果标本中不包含病原微生物核酸或核酸含量较低，则可产生假阴性结果，如局限性脑脓肿、一过性感染或低滴度（＜100拷贝）感染等。急性传染病精确诊断（The Precision Diagnosis of Acute Infectious Diseases，PDAID）的一项研究表明与传统检测方法相比，58例明确诊断为神经系统感染的患者中，有26例（45％）mNGS检测结果为假阴性，其中11例通过血清学诊断（如西尼罗河病毒）、7例为局限性脑脓肿、6例序列数低于报告阈值，2例未检测到病原体核酸[10]。
5. 高背景人源核酸干扰
mNGS微生物检测的灵敏度与标本人源核酸含量有关，人类基因组比细菌基因组大1000倍，说明临床标本mNGS会产生超过99%的宿主序列[46]，因此，mNGS技术产生的巨大数据集中，仅有极少数序列用来致病菌分析，很大一部分是人源、低复杂度、冗余和质量差的序列。如果宿主产生较强的免疫反应，标本中白细胞升高，病原微生物的相对含量将进一步降低，生信分析时若能有效去除人源核酸将提高微生物检测的分析灵敏度。尤其在病原体载量低的情况下，必须进行微生物核酸富集或宿主核酸去除[51]。但是，不同类型临床标本人源核酸平均含量不一，去除比例根据标本类型、病原体的核酸丰度及环境污染程度有很大不同，如脑膜炎的CSF中97-99%的序列可能是人源的，而病毒性肺炎的痰标本80%的序列来自病毒[34, 44]，去除效率过低或过高均可能降低检测灵敏度产生假阴性结果。
6. 干扰核酸去除与富集方法
目前，已开发出多种制备RNA文库的人源核酸的去除方法，如利用DNase I去除人源DNA[52]，抗人源线粒体和核糖体RNA抗体可去除标本中50-80%核酸序列[53]，但当病原体核酸含量极低时作用甚微，额外添加试剂还可能增加外源背景污染[54]。目前，尚无针对DNA文库的有效去除与富集办法。市售的DNA富集试剂盒，如NEBNext微生物DNA富集试剂盒（美国纽英伦生物技术公司）和MolYsis Basic试剂盒（德国Molzym公司）富集效率有限[52]。另外，虽然有研究表明利用非离子表面活性剂预处理标本，使人源细胞裂解而保留和富集具有细胞壁的微生物（如细菌和真菌），然后用DNase I降解背景DNA，可使微生物达到1000倍以上富集[52]。但无细胞壁的病原微生物如支原体或寄生虫可能也会在预处理阶段去除造成假阴性，因此，去除人源核酸的方法选择需要结合临床检测目的。
7. 数据库
多数测序公司选择NCBI数据库进行微生物序列比对，但是该数据库包含来自所有已知生物的基因组序列，来源世界各地，数据库庞大，部分基因组草图或序列包含错误信息，可能会由于标本的低质量读数（即计算噪声）与复杂度较低的序列、错误注释的序列、数据库条目中的污染序列相匹配而导致假阳性结果。与NCBI比对的序列，如有必要应二次验证。高精度的数据库（如FDA Reference Viral Database，RVDB[55]）包含已知病原体的高质量基因组信息，可减少微生物匹配错误的可能性，但未包含在该数据库中的病原体可能会因匹配不到而产生假阴性。鼓励有实力实验室根据我国感染性疾病特点自行建设数据库。
8. 污染
对过滤后的数据集进行微生物鉴定，首先应确定致病菌（一种或多种）与污染物的比例（如来自皮肤菌群或实验室试剂）。待测标本中致病菌含量很低时，扩增过程中使用的引物会扩增甚至最少量的环境污染物，从而增加最终数据集中污染物的比例造成假阳性[56]。有研究表明，在常用的DNA提取试剂及其他试剂中，外源DNA普遍存在，会严重影响结果判读，特别是微生物载量低的标本[57]。为了最大限度地减少低水平微生物污染导致的假阳性结果，可建立检测阈值标准，如CSF中某些代表性微生物的检出下限为0.16CFU/ml，如果病原体载量低于检测限也将产生假阴性结果[47]。对于未结合临床的生物信息分析而言，可能将有意义的病原微生物信息漏掉或错报。
9. 缺乏参考标准及质控品
大多数可用的参考品都是针对特定应用高度定制的，如Zymo BIOMICS微生物种群标准品（ZymoBIOMICS Microbial Community Standard），主要用于微生物种群及细菌和真菌宏基因组学分析[58]，美国国家标准与技术研究所（the National Institute of Standards and Technology，NIST）的参考品只包含细菌。当前，实验室多自建质控品，并利用“无模板”（即无菌水）和未感染的标本等构建背景污染菌模型，包括标本采集过程中的皮肤微生物、试剂中及实验室中的背景污染菌等。但是，由于缺乏通用的参考标准和质控品，无法确保mNGS分析的质量及稳定性，无法比较不同实验室间的检测性能。
10. 缺乏标准化的工作流程
目前，还没有FDA批准的用于感染性诊断的mNGS方法，一些实验室将标本发送给第三方实验室，而另一些实验室则构建自己的工作流程检测病原体[59]。然而，这些实验室开发的工作流程高度个性化，并且只适用于特定的感染类型或标本类型。从样品制备、试剂选择、测序过程到最终的生物信息分析管道等关键的工作流程不尽相同，缺乏标准化和方法验证，无法评估不同实验室结果，无法保证测序的准确性。
11. 确认实验
因不同类型微生物基因组长度和测序平台等的差异，导致无法针对所有微生物建立统一的阴阳性判读标准[60]。同时由于缺乏统一的解释标准，医师对mNGS的结果应持谨慎态度。mNGS阳性不能说明是致病菌，必须结合临床进行解释，必要时可与微生物学和分子生物学等专家共同研讨。如果在临床标本中发现非典型或新型病原体时应进行确认实验，如正交试验、血清学及特异性核酸扩增等，如有必要还应进行细胞培养或动物模型进行验证。
三、其他挑战
尽管宏基因组学快速发展，但在临床实验室开展该技术仍然问题诸多。① 微生物和宿主之间复杂的相互作用，如何影响人类健康？检测到的微生物是致病菌还是污染或是定植？②缺乏通用参考标准及方法学验证。③ 高成本、非医保、较长的TAT以及实用性等仍是开展mNGS的主要障碍[61]。④ 缺乏符合法规的管理体系。⑤ 如何将不断推陈出新的研究成果实时转变为临床所用？⑥ 缺乏标准化操作、专家共识或指南。
四、展望
1. 临床验证
国外一家临床微生物实验室已成功开发并验证了一种用于神经系统感染性疾病的mNGS检测方法，可从CSF中全面检测与脑膜炎和脑炎相关的病原体，并获得了CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments，临床实验室改进法案修正案）认证[62]。此实验室正在对检测其他标本及感染类型的mNGS进行临床验证，这将推动mNGS的临床实施并为其他实验室提供参考。在未来，随着参考品和质控品的研发、共识及指南的出现以及更多标准化mNGS平台的建立，不同实验室间的评估及验证将得以实现，测序结果将更加精准[4]。
2. 结果更精准
试剂盒及环境中的污染物不易去除，其准确识别对于mNGS结果解释至关重要，已有研究通过检测质控品鉴别出试剂和实验室环境中的常见污染菌并提出了相关指南[54]。以此建立基准数据库，如脑膜炎和眼内炎的常见污染微生物数据库[63, 64]，有利于消除来自正常微生物种群和环境污染物的干扰并提高结果的准确性[64]。另外，一些研究开发统计模型确定mNGS产生数据的优先次序，对鉴定的微生物进行排序，简化结果判读（例如Z分数算法）[64, 65]。测序深度，即单个样本可获得多少单个序列，随着测序平台的不断改进，增加测序深度提高mNGS灵敏性将成为可能。原则上背景简单的标本如脑脊液、血浆等（人源核酸含量低）较低的测序数据量即可满足病原微生物检出。测序数据量提升可显著提高灵敏度，以血流感染为例，每个样本平均20M序列时，总体灵敏度为31%[66]，每个样本平均24M序列时，总体灵敏度达到48%[67]，当每个样本平均数据量达到33M序列时，总体灵敏度达到71%。
3. 软硬件的革新
科技进步推动软硬件设备的革新。新一代测序仪（如Illumina NovaSeq仪器）的输出量大大提高，多路复用成为可能。使用机器人批量处理标本将显著提高实验室自动化程度。用于NGS样品库制备微流控设备（如VolTRAX116）将使mNGS在POCT领域得以开发利用[68]。无需PCR即可测定无限长度的核酸序列，还可直接检测到甲基化，同步表观遗传学分析的第三代单分子测序技术的兴起等[69]。此外，编程人员正在不断开发、验证和维护供临床使用的生物信息学管道，软件开发人员不断更新生物信息学分析的各种算法。文库制备方法、序列生成和生物信息学方面的技术进步正以更低的成本实现更快、更全面的宏基因组分析，相信在临床实验室专家、医生、制造商、平台和软件开发人员、生物信息学家及统计学家等多学科的深入合作下，mNGS会越走越远[70]。
五、总结
迄今为止，mNGS不仅可以很好地检测出罕见、新发、突发及混合感染的病原体，为危重或免疫功能低下患者的感染提供了新的诊断策略，其应用还包括疾病和健康状态下的微生物种群分析、转录组学探讨人类宿主与微生物的相互作用等。但是除感染性疾病的诊断外，mNGS在其他领域应用依旧缓慢，多数尚未纳入常规临床实践。尽管仍不可能取代传统方法，但在某些情况下mNGS作为一种补充技术必不可少。随着测序技术的快速发展，预测在几年内mNGS的检测速度和准确性将得到显著提高。加快技术创新，鼓励更多高质量的测序平台参与市场竞争，将促进mNGS总成本和TAT降低、强大的富集及去人源方法的涌现、越来越多基于mNGS技术的诊断方法获批。总之，mNGS技术不断发展成熟，有望成为一种快速、可靠的病原微生物鉴定手段，并在不久的将来广泛应用于临床。
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