质谱MRM 技术在蛋白质组学研究中的应用

军事医学科学院放射与辐射医学研究所；蛋白质组学国家重点实验室；北京蛋白质组研究中心     赵 焱　应万涛　钱小红

       摘要：质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术是一种基于已知信息或假定信息有针对性地获取数据，进行质谱信号采集的技术，具有灵敏、准确和特异等优点。在基于蛋白组学的生物标志物研究、蛋白质翻译后修饰、定量蛋白质组和蛋白质相互作用等研究领域的应用逐渐受到重视。该文概述了该技术在蛋白质组学研究中的应用特点及其最新应用进展。
       关键词： 质谱多反应监测( MRM ) 技术；蛋白质组学

       蛋白质组学的研究对象是一个在时间和空间上动态变化的整体，具有极端的复杂性。随着蛋白质组学研究的深入和发展，尤其是差异蛋白质组学研究的进展，大量功能蛋白质和潜在疾病蛋白质标志物被发现并被鉴定，如何进一步探测这些蛋白质的表达丰度，以阐明其功能和在疾病研究中的意义，已变得越来越重要。仅仅依赖蛋白质大规模分离、鉴定的技术路线(双向凝胶电泳技术分离蛋白质，质谱技术鉴定蛋白质) 已经不能满足这些研究的需求，迫切需要更高灵敏度和更高选择性的研究方法。而质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术作为一种高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，在进行蛋白质组学更具针对性的研究中发挥了重要作用[1]，逐步受到更多的研究者们关注。

1. MRM 技术的原理

       MRM 技术是基于已知信息或假定信息设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，去除大量不符合规则离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。具体地说，即是根据多肽母离子质量数和碎片离子质量数，选择母离子- 子离子对，允许符合设定的母离子进入碰撞室，碰撞完成后，只记录设定子离子信号。通过母离子和子离子的两次选择，去除干扰离子，降低化学背景，提高灵敏度[2]。在分析化学领域，这种质谱扫描模式已成熟地用于复杂体系中小分子化合物的分析，如环境分析、毒物分析、药物代谢物分析等[3,4]。而近年来MRM 技术与多种质谱扫描模式的灵活结合，例如MIDAS(MRM-initiated detection and sequencing，是基于MRM 获取的信号结果，对达到设定信号阈值的多肽再进行高分辨产物离子扫描，从而对目标肽段进行高灵敏度鉴定的方法)，使复杂目标物的定性结果更为可靠，拓宽了其在蛋白质组学领域的应用。

2. MRM 技术的特点

       灵敏度高：MRM 技术通过两级离子选择，排除了大量干扰离子，使质谱的化学背景大大降低。目标检测物的信噪比显著提高，能够完成其他质谱扫描方式所望尘莫及的高灵敏度检测。
       重现性好：质谱信号重现性差在一定程度上是因为复杂生物样本基体和共流出组分对待测分子离子化、质谱信号的抑制及源内碰撞碎裂过程的影响导致。而在M R M 技术质谱信号采集中，后两者的影响被大大降低，因此重现性也相应提高。
       准确度高：利用MRM 技术特异性，对符合设定的多肽进行检测，并且进一步进行增强产物扫描分析，得到高分辨的串联质谱(MS/MS)碎片数据，使分析过程中的定性结果假阳性率大大降低。该技术与中性丢失相比，后者易检测到一些产生相似质量丢失的假阳性肽，而一些不易产生中性丢失的目标肽也有可能没被检测。而MRM 技术则寻找产生特异碎片的特异母离子，鉴定准确度高于全扫描和中性丢失质谱扫描模式。
       通量高：使用目前最先进的质谱系统，MRM 技术每个工作循环能处理多达300 对母离子- 子离子，这种特点为研究多种蛋白质的多种修饰和丰度变化提供了机会，更能满足蛋白质组学的研究需求。

3. MRM 技术在生物标志物检测中的应用

       运用蛋白组学的方法进行生物标志物的发现和检测是目前蛋白质组研究的热点。随着蛋白质组学技术的发展，采用二维凝胶电泳或鸟枪法(shotgun)技术寻找上调或下调蛋白质以发现生物标志物的研究策略已得到很大的丰富和完善。目前，标志物发现- 验证- 临床确证的研究模式已得到研究者们的广泛认可[5,6]。即在发现阶段从疾病组织中寻找与正常组织有差异的蛋白质，到验证阶段使用MRM 技术于组织周边体液或血浆中检测该差异蛋白质，利用子离子谱进行定性，最后用MRM 技术和同位素稀释或质量标签标记(mTRAQ)的方法对筛选出来的标记物定量，进行临床确证。这种研究模式使体液中生物标志物的发现和验证更为有效、科学和合理。MRM 技术与金标准ELISA 相比，周期更短、成本更低，更重要的是能进行与同一疾病相关的多个标记物同时测定且不需制备其相应的抗体，具有极大的应用优越性。
       MRM 技术在验证和确证阶段都有极其重要的应用，充分体现了该技术在生物标志物检测领域的价值。例如，在Whiteaker 等[7]的研究中，以小鼠为模型研究乳腺癌的生物标志物；用液相色谱串连质谱(LC-MS/MS)对肿瘤和正常乳房组织的蛋白质进行检测，筛查出700 个以上差异蛋白质；再联合抗体和MRM 技术最后鉴定了fubulin-2 作为血浆中的生物标志物。实验结果进一步验证了MRM 技术验证生物标志物的方法，在发现新型生物标志物研究中的可行性。
       Kuhn 等研究[8]表明，MRM 技术与同位素标记相结合进行绝对定量分析，可以节省分析时间，并且能得到与抗体和免疫分析等经典验证方法具良好相关性的检测结果。他们采用同位素标记合成肽段和MRM 技术相结合，检测来自类风湿性关节炎患者血浆样本中诊断标记物C- 反应蛋白的浓度，并对方法的回收率、线性等进行了考察，结果能达到高达66%的回收率和3 个数量级以上的线性范围。

4. MRM 技术在蛋白质翻译后修饰研究中的应用

       蛋白质翻译后修饰在许多生命活动的调节过程中起到非常重要的作用。蛋白质翻译后修饰过程的阐明，有利于人们更深刻地理解生命体的生理和病理过程。以蛋白质磷酸化修饰为例，MRM 技术在翻译后修饰的研究领域中显示了其独特的特点和优势。例如，磷酸化蛋白质被酶切后，磷酸化多肽的信号淹没在大量非磷酸化多肽的信号中，需要进行磷酸化多肽的富集来提高分析灵敏度，改善分析效果，但即便如此仍难以获得满意的分析结果，灵敏度低遗漏大量信息。而以下几个实例则充分展现了MRM技术在蛋白质磷酸化分析中的优势。
       Unwin 等[9]采用MIDAS 模式在对蛋白质磷酸化修饰研究所得到的结果中，既使对于500 fmol 蛋白质混合物中仅有20 fmol 磷酸化蛋白质这样信号被高度抑制的情况，也能够得到磷酸化多肽的检出，比用母离子检测动态范围提高了一个数量级。
       Wolf-Yalin等[10]在用IDA(information dependant acquisition；选择一级质谱信号中丰度最高的三个离子进行子离子扫描的一种质谱信号采集方式)-MRM 方法定量分析蛋白质磷酸化介导的信号通路过程中，比较了IDA 信号采集模式和MRM 信号采集模式对酶切多肽混合物四次分析得到的肽段鉴定重复性实验结果，前者的重复性仅为34%，而后者高达88%。重复性的提高体现了MRM 技术的优势，更有利于对磷酸化修饰的动态变化进行监测和构建其相互作用网络。
       Ahmed 等[11]同样采用MRM 的方法，对细胞内外生物标志物的多种修饰进行研究，定量了16 个生物标志物，并对这些细胞内外蛋白质修饰的功能作了初步阐释。

5. MRM 技术在定量蛋白质组学研究中的应用

       复杂组分共流出物的干扰和宽达9 个数量级以上的动态范围，一直是影响血清或血浆等生物体液中蛋白质、多肽准确定量的关键因素。尽管研究者们也尝试采用多种方法，包括尽可能充分的色谱分离，去除高丰度蛋白质等，但质谱对低丰度蛋白质的检测灵敏度和精密度仍不能满足分析的要求。MRM 技术在定量蛋白质组学应用上展现了其方法的优点。首先，在一定程度上提高了测定的动态范围，其原因一方面是因为对离子的选择检出，降低了复杂组分的背景信号，增强了一些低丰度蛋白质的检测灵敏度；另一方面通过对高丰度、低丰度蛋白质MRM 离子对的选择来均衡两者的响应信号差异。例如，对高丰度蛋白质，选择响应丰度较低的母离子- 子离子对；对低丰度蛋白质，选择响应程度较高的母离子- 子离子对，从而均衡高、低丰度的信号差异。其次，减少了复杂组分共流出物的干扰，增强了检测的特异性。此外，MRM 技术高通量的特点，也为多种蛋白质的同时定量提供了条件。MRM 技术通过与同位素稀释法或mTRAQ 技术结合，对已知量加入的内标肽段和样本中的真实肽段分别进行标记，选择不同母- 子离子对获得不同的色谱检出信号，比较两者信号，从而产生绝对定量结果[12,13]。
       Anderson 等[14]用MRM 技术定量分析了人体血浆中53 种高、中丰度蛋白质。其中47 个数据同批变异系数为2%～22%，显示了定量的良好精密度。分析结果的动态范围达到4.5 个数量级。Lin 等[15]用MRM 定量测定了人体血浆中中等丰度蛋白质的实际浓度。测定结果表明其浓度范围达到了3～700 nmol/L。12 次反复测量变异系数(CV)值小于25%。对于血浆中的低丰度蛋白质，Keshishian 等[16]也采用MRM 和同位素稀释的方法进行了定量分析。在未进行蛋白质或多肽亲和富集的条件下，去除血浆6 种高丰度蛋白质后，低丰度蛋白质的检测限在1～10 mg/L，CV值在3%～15%，与质谱直接检测血浆蛋白的方法相比，分析性能改善了1000 倍。实验结果显示了这种MRM 技术进行绝对定量的高精密度，以及用于分析复杂样本的高动态范围。

6. MRM 技术在蛋白质与RNA 相互作用研究中的应用

       蛋白质- RNA 复合物在调控真核细胞的基因表达上具有重要意义。基于MS 的方法研究蛋白质与RNA 的相互作用多有报道，而采用MRM 与其他技术相结合的方法，能更深入地研究蛋白质与RNA 作用的结构域，得到更丰富的相互作用结构信息。其原理是：通过母离子扫描的模式，获得含有磷酸碎片的所有多肽离子的准确分子量和电荷数。设计MRM 离子对，母离子扫描获得的信号离子作为母离子，子离子设定为碱基序列AUGC ，在MRM 的检测域值达到设定值后，进行高分辨增强子离子扫描, 最终获取蛋白质序列信息和与其作用的RNA 序列信息。
       Lenz 等[17]采用此方法，研究了U1SnRNP 和1515K-61K-U4atacSnRN 与RNA 的相互作用信息，分别用胰蛋白酶和RNA 酶T1、A 对蛋白质和RNA 进行酶切，得到相互作用的最短肽段和RNA 的最短序列，在负离子模式进行母离子扫描，依据获得的结果设计MRM 母- 子离子对，在正离子模式进行MRM-子离子增强扫描，最后得到了相互作用结构域等更为详细的信息。

7. 展望

       MRM 技术是基于蛋白质或多肽的已知信息或假定信息进行质谱信号采集，有针对性地获取数据的方式。通过与其他质谱扫描技术的联合使用，能在蛋白质组研究中充分展现其高灵敏度、高准确性、高重复性、高通量的应用优点。可以预见，通过对MRM 技术的进一步优化，例如优化MRM 母－子离子的选择条件，从已有的蛋白质谱中人工获取或利用软件计算母- 子离子；优化每次运行MRM 离子对的数目，改善色谱峰形，或者通过设立不同时间段检测离子对，增加分析通量；联合其他多种质谱扫描技术，将使MRM 技术拥有更好的应用前景，更有效地满足蛋白质组学的分析需求。

参考文献
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                                                                                            编辑：范伟伟