几种不同即时检测场景中的人工智能应用
【摘要】随着全球人口的增长，当前的医疗服务模式将面临严峻的挑战。无论在发达国家还是发展中国家，农村和偏远地区都面临着同样的挑战：没有医院、缺乏训练有素和熟练的检测人员以及不遵守质量保证规程。使用人工智能（AI）的即时（床旁）检测有望解决这些挑战。在这篇综述中，我们重点介绍了人工智能在即时检测中的一些关键应用领域，包括侧流免疫层析测定、明视野显微镜和血液学，展示了这一快速发展的检验医学领域。
【关键词】人工智能；即时检测；侧流免疫层析测定；血液学；明视野显微镜；卷积神经网络
科学技术进步带来的生活水平提高导致全球人口老龄化加剧。此外，预计到2030年，世界人口将达到85亿，到2050年将达到97亿，到2100年将达到112亿。现有的医疗资源无法有效满足这一快速增长的人口需求，这对全球的公共卫生项目提出了挑战。即时(床旁，POC)检测，即在医院床边、药房、社区中心或患者家中对患者进行检测和治疗，提供了一种可行的医疗保健解决方案。实施POC检测的挑战之一是确保结果可靠和正确解读，这需要经过适当培训的用户和质量保证实践。人工智能（AI）正在为POC检测做出重要贡献，并有望帮助解决卫生保健工作者面临的许多挑战，以及直接面向消费者检测的广泛应用。在这篇综述中，我们强调了一些重要的例子，其中AI促进了这一快速发展的领域的发展。
一、AI的背景
人工智能（AI）是一门广泛的学科，包括机器学习（ML）、机器人和视觉计算，不过，本文只讨论AI中与POC测试相关的方面。ML是人工学习的一个子集，用于创建解决问题和构建“智能机器”的算法。因此，ML是AI的“大脑”。目前，POC测试中最常用的ML算法是“监督学习”，即给机器提供“输入”和相关“输出”，当提供一个新输入时，就会扫描内存以识别相关输出。在20世纪60、70年代，ML算法依赖于线性的“如果-那么”关系。然而，随着我们对人脑功能的理解不断加深，科学家们试图在ML中更好地模仿人脑功能，从而导致了神经网络（NNs）的发展。人工神经网络（ANN）由以下节点层组成：输入层、隐藏层和输出层。每个节点都与另一个节点相连，并与特定的权重和阈值相关联。也就是说，正权重和负权重代表对输入的单独响应，从而产生输出。如果一个节点的输出超过特定阈值，该节点就会被激活并向下一个节点发送信号；反之，则不会发送信号。
因此，ANN是ML的一个例子，它使用信息并帮助计算机根据存储的示例或以前的遭遇生成输出。卷积神经网络（CNN）最适合处理图像、语音或音频信号输入，主要有三种类型的层：卷积层、池化层和全连接层。总之，随着图像数据通过CNN层，模型开始识别物体的较大元素或形状，直至最终识别出目标物体。
二、AI和侧流免疫层析测定（LFIAs）
LFIA是最常见的POC检测诊断平台之一，因为它能在短短10min内提供检测结果。LFIAs易于执行，用户友好，并具有符合世卫组织POC检测“ASSURED”基准的成本效益特征（A=经济实惠，S=灵敏度，S=特异性，U=用户友好，R=稳健，E=无需仪器，D=易获取）。LFIA通常使用金纳米颗粒（GNP）与检测目标抗原的抗体偶联。然而，由于LFIA结果的解读依赖于目视观察对照线和检测线的能力，因此灵敏度存在一些限制。用荧光团代替GNP提高了LFIA的灵敏度，然而，它们在室温下储存不稳定性和容易发生光漂白，限制了它们的使用。量子点的使用提高了光稳定性，从而产生了大摩尔消光系数和高荧光量子产率。然而，量子点会产生高自发荧光。这些光学测试平台的另一个局限是无法测量表层下的信号，只能根据红、绿、蓝光或灰度扫描来解读结果，这限制了其灵敏度和准确性。Yan等人使用与抗体偶联的磁性纳米颗粒，并使用磁性免疫测定仪测量了人绒毛膜促性腺激素（hCG）、心肌肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶MB和肌红蛋白的磁信号，这种方法能够检测到整个检测区的信号，而不受不透明性或高信噪比的影响。此外，对于试纸上的弱磁信号（10-7-10-4 Oe），他们使用了一种基于支持向量机分类器和自定义波形重建的新型数据处理方法，从而显著提高了检测的灵敏度和准确性。hCG定量检测范围为1-1,000mIU/ml，检测限为0.014mIU/ml。考虑到实验室仪器的临界值通常＜5mIU/ml，这是一个非常低的浓度。
将AI用于LFIAs的关键步骤是建立一个图像库。Turbé等人使用两种不同的HIV LFIAs建立了一个图像库。两种LFIAs的工作流程相同：将一滴指尖血滴在垫子上，加入缓冲液以帮助样本通过毛细作用在纸或固体支撑膜上移动，10-40min后，抗原-抗体反应产生与“测试”和“对照”线相对应的可见线，对应于表示验证阳性或阴性的检测结果。虽然LFIA对POC检测很有吸引力，但由于检测线有时会很模糊或使用者可能患有色盲，因此结果判读的准确性可能在80%-97%之间，具体取决于使用者的培训和经验。为了弥补HIV LFIAs的这一不足，我们开发了一种深度学习算法，每例患者均使用POC LFIAs进行检测；使用集成了本地Android相机应用程序的三星平板电脑（SM-P585）8M像素相机（f1/9）自动对焦功能，捕捉图像并发送到移动医疗系统。对作为移动应用程序部署的算法进行的试点实地研究表明，与传统的由人工（包括经验丰富的护士和新培训的社区卫生工作者）进行视觉判读相比，灵敏度（97.8%）和特异性（100%）均有所提高，并减少了假阳性和假阴性的数量。
三、AI在明视野显微镜诊断测试中的应用
疟疾是一种由疟原虫属寄生虫引起的传染病，通过雌性按蚊媒介传播。2019年，世卫组织估计，全球有2.29亿疟疾病例，其中40.9万人死亡。五岁以下儿童是最脆弱的群体，占全世界所有疟疾相关死亡人数的67%（27.4万）。非洲区域估计占所有病例的94%，以恶性疟原虫感染为主。用显微镜鉴定外周血涂片中的疟原虫历来是疟疾诊断的金标准，并有完善的质量保证措施，因此，经过适当培训的医护人员可以正确量化寄生虫血症和鉴定寄生虫种类。
显微镜检查的检测限度一般为20个寄生虫/µL，在临床疟疾患者中，显微镜玻片检查的诊断灵敏度为75%。然而，在非恶性疟原虫疟疾、低寄生虫血症或局部免疫的患者中，检测限会更低。由于在资源有限的环境中不一定能找到熟练的显微镜医师或正常工作的显微镜，因此人们一直在努力开发更好的诊断方法，以便在偏远的农村医疗环境中也能方便地进行诊断。自动显微分析系统包括捕捉图像的硬件和应用算法解读图像并做出诊断决定的软件。如上所述，CNN是一种基于人类视觉系统的ML模型，它使用卷积的数学运算来解释捕获的图像，在图像相关任务中取得了巨大成功。EasyScan Go是由Motic（中国香港）开发的自动显微镜系统，可捕捉图像并使用CNN算法解释图像和做出诊断决定，Das等人比较了经验丰富的显微镜医师和EasyScan Go自动显微系统在诊断疟原虫血液涂片时获得的结果。EasyScan Go的诊断灵敏度为91.1%（95%置信区间[CI]：88.9%-92.7%），特异性为75.6%（95% CI：73.1%-78.0%）。对于高质量的片子，灵敏度相似（89.1%，95% CI：86.2%-91.5%），但特异性增加到85.1%（95% CI：82.6%-87.4%），片子的质量对特异性和灵敏度都有重要影响。尽管仍有改进的空间，特别是在低寄生虫血症和寄生虫密度病例的估计方面，但随着各小组目前的研究工作，预计AI将显著改善疟疾诊断。
血吸虫病是由特定扁虫—血吸虫引起的一种被忽视的热带病，影响约2.366亿人，主要在非洲。诊断是通过明视野显微镜识别尿液样本中的虫卵。操作人员的技能和经验很重要，因为低虫卵分泌的轻度感染很容易被漏诊。Oyibo等人设计了一种血吸虫镜，这是一种低成本、高质量的数字显微镜，也可以用作载玻片扫描仪。他们使用一个CNN模型，利用从现场采集的加标尿液和临床尿液样本中捕获的5,000个血吸虫虫卵图像数据库来识别图像。血吸虫镜由易于获取的部件构成，光学系统包括一个Raspberry Pi高质量相机模块V2.1（USA），配备Sony IMX477R堆叠背光传感器（中国香港）。为了直观地识别血吸虫虫卵，他们使用了4x放大率的物镜，不过，该设备的设计使得物镜可以很容易地与20x放大率的物镜互换。CNN算法对图像中的虫卵进行了清晰的识别，图像质量适用于符合现行诊断参考标准的血吸虫虫卵自动检测。显微镜医师使用该设备捕获了埃及血吸虫、曼氏血吸虫和钩虫卵的高质量显微图像，并在数字图像中清楚地识别了这些卵。在一项初步研究中，他们发现血吸虫镜具有80%的灵敏度，满足了WHO诊断血吸虫病的目标产品要求。
四、AI与血液学
血液学中对全血细胞计数（CBC）的常规要求给POC检测设备的开发人员带来了挑战，这主要是因为CBC不仅需要对细胞进行计数，还需要区分细胞的大小和形态，这在血液样本中可以跨越一系列细胞成熟度。
HemoScreen由以色列公司PixCell Medical开发，是首款获得美国食品药物管理局批准的POC血液分析仪，它克服了POC血液学检测中经常遇到的难题。要对体液中的细胞进行检测，必须将流体简化为单粒子流。流式细胞仪就是利用这种技术使荧光散射，进行细胞计数和形态分析。HemoScreen由一个分析装置和一个一次性检测卡盒组成，盒中装有检测所需的全部试剂。卡盒的一部分被称为“采样器”，直接通过指尖或静脉样本采集血液，然后放入分析装置，血液与试剂混合后进入半透明室进行光学分析和计数。通过一种称为粘弹性聚焦的现象（也称为Fahraeus-Lindqvist效应），血细胞会在层流下向微通道的中心线迁移并集中，这就形成了单层细胞，有助于光学分析。在细胞分析方面，HemoScreen使用的是机器视觉技术（图像处理和分析），而不是激光散射或阻抗。机器视觉技术能对数百个流动的细胞进行精确成像，捕捉独特的特征，然后通过AI算法识别单个细胞和亚型。可以识别细胞碎片和血小板的干扰，以避免错误报告结果。因此，操作者只需经过最少的血液学培训即可使用HemoScreen。
Sight诊断（以色列，特拉维夫）开发的Sight OLO POC血液分析仪使用计算机视觉进行图像分析。这与 HemoScreen相似，Sight OLO可以使用指血和静脉血样本，这两种样本都是在EDTA钾盐涂层管中采集。Hb检测需要17μl的样本量，而用于图像分析的细胞染色需要10μl，血液与稀释剂、干燥荧光染料混合。红色通道代表Hb，绿色通道代表细胞质染色，蓝色通道代表DNA核染色。POC血液学的一个挑战是识别血涂片中异常细胞的能力。制备单层血涂片的过程对于鉴定细胞类型是必要的。然而，这需要技术技能，而在紧急危机期间或偏远农村地区的POC可能并不总是具备这些技能。Sight OLO采用新颖的工艺规避了这一问题，稀释后的细胞通过毛细作用被吸入成像室，成像室的尺寸使细胞沉淀后形成单层。使用Sight OLO自动明视野和荧光显微镜可对这些单层血液涂片进行快速成像，该显微镜根据光学和化学特征捕捉单个血液样本的数千张多光谱图像。多光谱图像在五个波长下生成：红色（633nm）、绿色（577nm)、蓝色（460nm）、紫色（405nm）和紫外线（365nm）。这些不同的波长可以识别红细胞、白细胞和血小板。
此外，Sight OLO使用三种不同的分析流程来计数和表征红细胞、白细胞和血小板。这三个工作流程均涉及一个两步流程，首先识别出一批初步的候选者，然后对这些候选者进行进一步分析以确定最终身份。明视野图像用于识别红细胞，如果红细胞之间距离太近，仍有可能重叠。因此，在确定候选红细胞后，要对其重叠情况进行筛查，并根据形态特征将其分割成单个细胞。利用CNN算法进一步确定红细胞图像的特征，以估算平均红细胞Hb、平均红细胞体积和平均红细胞Hb浓度等细胞属性。使用明视野和荧光通道识别白细胞。首先确定每个细胞的细胞核和细胞质，然后使用计算机根据不同特征进一步确定其特征。使用ML分析这些特征，对不同的白细胞类型进行分类，并使用分类算法识别异常细胞类型。要识别真正的血小板，首先要根据不同的形态和强度特性对候选细胞进行筛选，然后应用几种经过训练的CNN算法，以便在不同情况下将血小板从背景中准确区分出来。表1比较了HemoScreen和Sight OLO设备的特性。
五、用于贫血和Hb变体检测的AI
贫血是一个严重的健康问题，影响着全球约三分之一的人口，在撒哈拉以南非洲地区，学龄儿童的贫血患病率高达91%。贫血的后果包括不良的出生结局、认知和行为发育受损以及成年后生育力下降。在资源有限的国家，贫血和镰状细胞病与高死亡率和高发病率相关，造成了严重的健康问题。最近，An等人开发了一种POC微芯片电泳设备，可利用AI算法测量贫血和Hb变体。基于ANN的ML算法可测量Hb浓度。将全血稀释在标准校准液中，然后在醋酸纤维素纸上电泳。10min后，根据更精细的质荷比将Hb分离成亚型。然后通过将Hb条带强度与校准品的强度进行比较来确定Hb浓度。采集Hb波段（红色）和校准波段（蓝色）的高分辨率图像，包括所有相关像素信息。图像视频中的每一帧都按顺序分割成红色和蓝色通道。然后将这些信息作为输入特征向量馈送到训练有素的ANN，该ANN会检查强度比模式并报告相应的Hb浓度（g/dL）（图1）。最后根据结果确定患者的贫血状态。使用该系统检测贫血的灵敏度为100%，特异性为92.3%。识别镰状细胞病患者的灵敏度和特异性均为100%。总之，该平台使用单一的POC检测设备实现了贫血检测和 Hb变体鉴定的一体化。
注：（A）将全血样本（红色）与标准校准物（蓝色）混合并在醋酸纤维素纸上电泳；（B）2.5min内，Hb与标准品分离，使用ML ANN测定Hb浓度和贫血状态；（C）在8min内，将Hb分离成不同的变体，并确定主要变体（改编自An等人）
图1. 贫血和Hb变体POC检测的电泳过程示意图
六、结论
AI在POC检测中的应用将带来彻底和永久性的变化，就像信息技术在20世纪80年代影响检验医学一样。AI在POC检测中的最大优势是能够可靠、准确地进行必要的诊断测试，而不需要熟练或训练有素的人员。这将极大地影响基层医疗服务，避免资源有限国家的人口向城市地区迁移的趋势，防止不必要的人满为患和自发性贫困，同时提高偏远和农村地区居民的生活质量。
编译节选自：Ann Lab Med. 2023 Apr 21; 43(5): 401-407.
