现代质谱技术在蛋白质组学中的应用及其最新进展
南昌大学生命科学学院 王希，朱友林
【摘要】简述了蛋白质组学的概念、内容和意义，重点综述了现代质谱技术在蛋白质组学中的应用，主要包括蛋白质和肽段的鉴定和定量、蛋白质翻译后修饰的鉴定和蛋白质间相互作用的检测等。随着新的高质量精确度、分辨率、灵敏度和通量质谱仪的出现，现代质谱技术在蛋白质组学中的应用将越来越广泛，并给蛋白质组学研究带来新的机遇。
【关键词】蛋白质组;蛋白质组学;生物质谱
1 蛋白质组学及其意义
随着人类基因组测序计划的顺利完成，生命科学进人了新的时代—后基因组时代，功能基因组学成为研究的重心，蛋白质组学则是研究的热点。现今对蛋白质(proteome)的理解为:一个基因组、一种生物或一种细胞(组织)在特异时间和空间所表达的整套蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学(proteomics)则是以蛋白质组为研究对象的一门新兴学科，其研究内容包括动态变化的蛋白质组成成分、修饰状态的鉴定、表达水平的定量检测、细胞或亚细胞内定位、相互作用、结构与功能的关系等。
按研究内容可将蛋白质组学分为两大类:表达蛋白组学网(expression proteomics)研究基因编码的所有蛋白质的识别和定量，及其在细胞中的定位和在转录后阶段进行的修饰;功能蛋白组学门(functional proteomics)又称细胞图谱蛋白质组学(cell map protemocis)或互作蛋白质组学M(interaction proteomics)，研究蛋白质之间的相互作用，确定蛋白质在特定通道和细胞结构中的作用，说明蛋白质结构和功能间的相互关系。
在后基因组时代，蛋白质组学研究有着十分显著的意义。首先，可给基因以详细的注释;其次，根据生物学的中心法则，基因仅仅是遗传信息的携带者，而全部生物功能的执行者却是蛋白质，细胞分裂、生长、凋亡等都是由蛋白质复合物信号转导的队最后，蛋白质组学研究有着巨大的现实应用意义，如癌蛋白质组学在研究癌症的发生发展、诊断治疗，以及药物设计、筛选及开发中起着越来越重要的作用，它为最终获得诊断癌症的分子标记、治疗癌症和发现癌症的发生发展机制提供了不可多得的证据。
2 生物质谱在蛋白质组学中的应用
作为蛋白质组学三大支撑技术之一的现代质谱技术，在蛋白质和肤段的鉴定、定量和结构阐述方面所起的作用是不可或缺的。质谱仪的基本原理为:使用软电离技术使经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷，然后通过它们质核比的差异使其得到分离并检测出其质量。质谱仪通常包含3个部分，即离子源、质量分析器和检测器。基质辅助激光解吸附电离技术(matix-assited laser desorption/ionization,MALDI)和电喷雾电离技术(electrospray ionization,ESI)是目前最常采用的离子化技术，也正是由于它们的出现，加上过去十几年中所积累的核酸和蛋白质序列信息和软件、数据库的开发与运用，才使得质谱技术能广泛成功地运用于蛋白质组学中。质谱仪中最重要的部件是质量分析器，它决定了质谱仪的灵敏度、分辨率、质量精确度、可测分子质量范围等重要参数。常见的质量分析器有飞行时间(time of flight,TOF)、四极杆(quandruple)、离子脐(iontrap,IT)和较新应用的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(fourier trans-form ion cyclotron resonance masss pectrometry,FT ICR MS)。它们的设计和性能不尽相同，各有其优缺点，既可以单独使用，也可以串联起来使用，以充分发挥各自的优点。现代质谱技术在蛋白质组中的应用主要包括以下内容。
2.1 蛋白质和肤段的鉴定
2.1.1 运用单级质谱仪的肤质量指纹谙鉴定方法 肽质量指纹谱(peptidem assfi ngerprinting,PMF)是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶(如胰蛋白酶)水解后得到的肤片段质量图谱，由于每种蛋白质的一级结构(氨基酸序列)不同，所以PMF具有特征性，可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的PMF与数据库中已有的理论PMF相匹配。PMF常用的搜索程序包括PeptIdent,M SFit,ProFound,MOWSE等。此法常用的质谱仪是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(MALDI time of flight mass spectrometry,MA LDI-TOF-MS)， 其优点为盐离子耐受能力高、谱峰简单、易于自动化和通量化;其缺点为容错性低、肤段质量冗余(peptide mass redundancy)、保守性替代、多态性、DNA水平的6种可能翻译，均可导致蛋白质的错误鉴定，仅能用于单一蛋白或简单蛋白混合物的鉴定am。因此，以往只能较好地适用于已完成测序、数据库注释详尽的小基因组的生物。但是由于质谱仪测定质量的精度普遍得到提高，搜索数据库所用的算法也更强大，如今已经发展了用于未完成基因组测序物种的蛋白质鉴定的跨物种同源性比对算法，所以PMF法仍是当之无愧的大规模蛋白质组研究的首选方法，也常用于蛋白质鉴定的第一步。
2.1.2 运用经典串联质语仪的蛋白质鉴定方法 经典的串联质谱仪(tandem masss pectrometry,MS /MS)有三级四极杆质谱仪(tripleq uadrupole,TQ ) 、离子阱质谱仪等，其主要由3部分组成，即离子源、多级质量分析器及碰撞室。经过一定选择的前体离子(precursor ion)在碰撞室发生低能碰撞诱导断裂(low-energy collision-inducedd issociation,CID;又称碰撞辅助断裂，collision-assistedd issociation,CAD;最近已研究出断裂过程的定量模型),结果是前体离子肤骨架酞胺键的特异性断裂，并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y型和b型等离子。获得CID二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质:①较常用的肤序列标签鉴定方法(peptide sequence tag,PST)，根据由二级质谱图解析(可自动)出的部分氨基酸序列(sequence tag)加上前体离子的质量和与肤序列标签相邻的产物离子(production)质量，再加上所用的蛋白酶等限制性参数，通过检索程序PepSea等搜索数据库而鉴定出蛋白;②直接用前体离子产生的未解析的CID图谱与数据库中的CID图谱比较，如Sequest,Mascot,Sonar等算法;③从头测序法(de novo sequence)，通过直接解释MS/MS数据识别肤序列，这类系统和算法有Lutefisk,SHERENG,PEAKS ,AuDeNS等。由于大规模数据库和计算机算法的发展，蛋白质的从头测序法显得没那么必要，但是它仍有独到的用处，如获得数据库中没有的蛋白序列信息、为人工证实MS/MS数据库匹配结果提供经验、分析数据库匹配后剩下的高质量质谱图等。但其自动化程度不高，现在最好的从头测序仍是人工解析数据。因为串联质谱鉴定蛋白质利用了肤段氨基酸序列的特异性，其鉴定蛋白质的特异性更高，仅一条肽段就可鉴定蛋白质，所以可用于蛋白质混和物的鉴定，且做适当调整后可鉴定蛋白质翻译后修饰，它是目前鉴定蛋白质最常用的方法;其缺点是样品须纯化，难于自动化，相对于MALDI-TOF法费时，通量化程度低。
2.2 蛋白质翻译后修饰的鉴定
现已发现了300多种蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)，在PTMs 的研究中关于磷酸化、糖基化和泛素化的研究比较多。磷酸化修饰是最普遍的翻译后修饰，机体利用可逆的蛋白磷酸化来控制许多细胞过程，包括信号转换、基因表达、细胞周期等，蛋白质激酶/磷酸醋酶的调节不当会导致癌变。用质谱分析法，一般先采用一定的方法，如抗丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸抗体的免疫亲和色谱IN，或固相金属亲和层析(immobilizedm etala finityc hromatography,IMAT)，或b-消除后再掺入同位素编码亲和标签富集磷酸肽，再通过串联质谱仪的前体离子扫描(precursor ion scanning)或中性丢失扫描模式(neutral loss scanning)先检出磷酸肤，再分析磷酸化位点。蛋白质的糖基化与细胞识别、膜戮合物、酶活力、蛋白质间相互作用有着紧密的联系。糖基化蛋白一般通过凝集素纯化富集，经糖苷酶催化的18O稳定核素标记后用串联质谱分析。介导蛋白质降解的泛素化作用也可通过以上类似方法鉴定。
2.3 定量蛋白质组学
随着蛋白质组学技术的兴起和逐渐成熟，以精确定量和鉴定一个基因组表达的全部蛋白或一个复杂的混和体系中所有蛋白质为目的的定量蛋白质组学(quantitativep roteomics) 便成为蛋白质组学的重要组成部分。目前用于蛋白质定量研究的方法主要有三大类。首先，运用最早和最成熟的技术就是双向电泳和质谱的结合，然后出现了双向差示凝胶电泳(fluorescence twodimensionald iferentialg ele lectrophoresis,2- D DIGE)，即通过在同一块2D胶上分离预先已用双色荧光染料差异标记的样品而达到定量的方法。其次，就是蛋白质芯片技术(protein chip/microarray)。第三，是因为引入了内源标准—核素而使定量更为精确的稳定核素标记技术(stable isotope metabolic labeling)、核素亲和标签技术(isotope-coded afinity tag,ICAT)IN与质谱联合使用，以达到精确相对定量的方法。ICAT法比稳定核素标记技术法(现仅适用于微生物)的通用性更高，但因引人了ICAT 试剂，导致数据库搜索算法的复杂性增高，所以又出现了可切割的ICAT法。
2.4 蛋白质间连锁图(protein linkage mapping)的建立
蛋白质是基因功能的主要执行者，通常以许多大小不一的蛋白质复合物的形式参与各种细胞过程。与质谱连用的蛋白质相互作用检测主要包括以下2种。
2.4.1 表面增强激光解吸电离质语芯片技术(proteinchip surface enhancedl aserd esorption/ionisation,SELDI) 此技术将蛋白质芯片与质谱联合应用，将蛋白质样品制备、生化反应和检测分析等过程都集中在芯片上进行，具有快速、灵敏、通量高、自动化等特点，应用前景广阔。如将以该技术得到的血清蛋白质组图谱用于癌症诊断，现已广泛应用于寻找肿瘤(如前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食管鳞癌、膀胧癌、肺癌、头颈部鳞状细胞癌等)标志物的研究，并取得了不俗的成果。然而这项技术还有待于进一步的成熟，须解决一系列问题，如保持固相化在芯片上的蛋白质构型以维持其生物活性、改善芯片表面处理，以及检测手段等。
2.4.2 表面等离振子共振与生物传感芯片质谱 由Wood发现(1902年)和Fano解释的(1941年)表面等离振子共振(surface plasmon resonance,SPR)是一种物理光学现象。生物传感芯片质谱(biosensor chip mass spectrometry)就是生物分子相互作用分析(biomolecular interaction analysis,BIA)和基质辅助激光解吸电离时间质谱的有机结合。首先，蛋白质(如配体等)固定于安装在SPR仪内的传感器表面，当蛋白质溶液流过液流室(flow cell)时，若特定蛋白(被分析物)能与配体结合，则等离振子共振信号就发生改变，此信号经光电二极管阵列测量后就能检出蛋白质的相互作用，然后被结合的蛋白质经蛋白酶消化后就能通过MS 得到鉴定。该方法属于实时和非标记的测试方法，优点是在测定生物分子的尺寸和浓度的同时能研究其结合和解离的动力学行为，具有直接提供分子间相互作用信息的本领，可以发展成具有广泛通用性的新型生物研究平台。然而这种方法存在通量性问题。2001年Laukens等用SPR结合ESI Q-TOF MS，发现了细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶和2种同工型2-磷酸核苷激酶可与烟草亮黄2细胞(BY-2 cells)的cAMP发生作用。
3 新一代的质谱仪给蛋白质组学带来的机遇
混和质谱仪— 基质辅助激光解吸电离-四极飞行时间质谱(MALDI-quandruple time of flight)技术兼具肤指纹图谱的大规模和串联质谱的可直接获得肤序列的双重优点，从而成为生物质谱家族中的新宠。另外，特别值得注意的是FTICR MS，它将给或已经给蛋白质组学带来的影响更为深刻。首先，因为其具有无可比拟的质量测定精确度(1 ppm)，便产生了一种新的鉴定蛋白质的策略—精确质量标签法(accurate mass tag,AMT)。AMT法提高了蛋白质测量的灵敏度，其动态范围和通量可以检测出传统手段检测不出的肤段。其次，由于FTICR MS可以实现对完整蛋白质的分析，所以直接导致从上到下蛋白质组学(topdown proteomics，或称为top-down mass spectrometry)的出现。它是相对于传统的对肤段混和物进行质谱分析的从下到上蛋白质组学(bottom-up proteomics)而言的，是指蛋白质的混和物经由气相分离后再在FTICR MS中使已知完整分子量的蛋白质离子断裂，在未经广泛的分离和消化的情况下，可从完整蛋白质的气相解离中直接得到蛋白质的一级结构。其优点非常显著，可避免从下到上蛋白质组学中所要求的冗余鉴定，能对全蛋白进行完整分析(对相对分子质量小于70 000的蛋白质的序列覆盖率可达100%)，而且因为蛋白质的m/z更宽，简化了复杂混和物中蛋白质的鉴定，在鉴定蛋白质的同时还能鉴定编码多态性(coding polymorphisms,cSNPs)和翻译后修饰。最后，迄今只用于FTICR MS的电子捕获解离(electronc aptiond issociation,EC D)是一种新的、非常有前途的快速特异性解离技术，它与传统的串联质谱技术互补，能导致二硫键的断裂，可以保留住氨基酸的二级结构和不稳定的翻译后修饰，提供更广的肤段覆盖率，且高能ECD能区分出亮氨酸和异亮氨酸。该技术将主要应用于证实从DNA推测出的蛋白质序列、二硫键分析;与传统的串联质谱分析蛋白质联用，可快速鉴定翻译后修饰。
总之，生物质谱已经在蛋白质组学研究中扮演着举足轻重的作用，而且伴随着新的质谱仪的出现，其在蛋白质组学中的应用将越来越广泛。
编辑：范伟伟
