检验人，当你开始依赖「新冠阳性质控」时，就输了！

作者：杨瑞锋北京大学人民医院，北京大学肝病研究所；丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室；国家感染性疾病临床医学研究中心分中心 4643 2022-04-07

应充分理解新型冠状病毒RNA检测阳性质控的局限性

检验质量不能过度依赖质控品

我国大部分地区新冠流行率极低，大多数实验室每天检测成千上万例的咽拭子样本，最终结果往往是全部“阴性”。

如何有把握地发送这些阴性报告？首先当然需要设置“阳性质控”（positivecontrol）。

阳性质控可在一定程度上提示，阴性结果为“真阴性”，而非检验失误造成的“假阴性”。然而，阳性质控设置仍存在“盲区”，质控在控，并不等同于检测质量高枕无忧。

01 分析前、分析中每一步都可能对新冠RNA逆转录（RT）-PCR结果产生负面影响

RNA检测是包含多个步骤的复杂过程，从病毒的收集到PCR（过程①→⑦），多种因素影响实验结果（如下图）。

02 新冠核酸试剂盒自带阳性质控的监控盲区

我国大部分新冠试剂盒自带阳性质控品为是双链环状DNA质粒，插入病毒N和ORF1ab等靶片段（如下图）。

质粒DNA不参与样本提取，而是直接加入每一批次的PCR反应板中，仅用于监控PCR体系是否有效（即过程④→⑦），但不能监控逆转录（RT）过程（过程③），也无法监控核酸采集和提取质量（过程①和②）。

03 内部质控（IC）的监控盲区

IC也习惯被称为“内标”、“内参”或“内对照”（innercontrol或internalcontrol），分为内源性（endogenous）和外源性（exogenous）IC。

我国新冠核酸试剂的IC一般为内源性，是RNaseP（核糖核酸酶P）等基因的DNA片段，源于人类细胞基因组，或血清/血浆中的游离DNA（cfDNA）。IC能被检出，证实一份咽拭子中含有人类细胞，间接提示取到了新冠病毒感染的细胞。

但是，由于内源性IC为DNA片段，同样也无法监控RNA提取效率和逆转录效率（过程②和③）。也就是说，即使RNA在处理过程中已经尽数降解，或新冠试剂的逆转录酶失效了，但内源性IC，连同试剂盒自带的阳性对照的结果，仍可能显示“在控”。

04 理想的IC往往求而不得

为克服RNaseP等DNA片段作为IC的局限，我们可选择人类看家基因（housekeepinggene）经剪接后的成熟mRNA片段作为IC（如下图），通过设计跨越内含子的引物和探针，进行RT-PCR，这是最接近理想状态的内源性IC，其质量监测作用可贯穿全过程（过程①→⑦），但可惜的是，咽拭子中人类细胞数量较少，看家基因的mRNA终浓度较低，因此，IC阳性率低，往往无法充分发挥监控功能，因此并没有被用于新冠核酸内源性IC。

05 第三方阳性质控的监控盲区

除了进行试剂盒自带阳性质控IC的检测，我们也纳入第三方试剂商提供的阳性质控作为实验室室内质控体系的补充。

第三方阳性质控一般为噬菌体（phage）（俗称“假病毒”）包裹的全长新冠RNA或RNA片段（N或ORF1ab等）。最常见的“假病毒”是二十面球体的噬菌体MS2（如下图）。

RNA虽极易被RNA酶降解，但若被噬菌体保护，就像披了一层盔甲的RNA（armoredRNA），因此相对稳定，质量好的盔甲RNA甚至可以在冷藏或常温的条件下放置数月而不被RNA酶破坏，成为稳定性良好的质控品。

在检测中，第三方阳性质控和待检样本一样，参与核酸提取和后续全过程，可模拟从RNA提取到RT-PCR的过程（过程②→⑦），尤其在理论上，可用于监控RNA提取质量和逆转录酶活性（过程②和③）。

但我们在实际应用中发现，多个品牌的第三方阳性质控，即使不参与核酸提取，直接将其加入PCR反应孔，仍然得到明显的S形扩增曲线。可能原因是，在50℃左右的逆转录（RT）过程中，噬菌体衣壳破裂并泄露RNA，进而被逆转录成DNA并被扩增。笔者认为，基于假病毒技术的第三方阳性质控品的这种特点，多多少少可能削弱其对新冠RNA提取过程（即过程②）的监控作用。质控品要做到尽善尽美，并非易事。毕竟它们只是尽量去模拟新冠RNA的检测过程，终究无法保证100%一致的条件。

06 阳性质控在控是发送“阴性”核酸报告的必要条件，但非充分条件

阳性质控在控，依然有“假阴性”结果的风险，特别是在RNA提取和逆转录过程，可能存在监控的盲区。检测者需在充分理解各种质控品的性质、功能及局限性的基础上，密切监控影响分子生物学检测的关键步骤，如有必要，可定期考察RNA提取试剂的提取效率和逆转录酶的活性等关键步骤，以最大程度降低新冠核酸漏检率。

编辑：骆秉涵

【来源：检验医学】

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