在新冠实验室工作，除了需要处理每天随着疫情紧张激增的标本，保证核酸检测结果准时、准确发放，还必须确保每个批次实验的室内质量控制在控。最令人头秃的，莫过于出现实验质控失控的状况！而导致失控的一些工作上的小细节却是容易让人忽略！
首先在这里简单描述下我科PCR实验室使用的扩增试剂和室内质控的情况：我实验室常规使用A和B两种扩增试剂，最低检测限为500拷贝/mL；弱阳性质控品使用的是第三方质控品，实验前使用生理盐水对质控品进行1：1稀释，日常实验使用稀释后的质控品进行实验。由于实验批次较多，以下案例经过仅列举具有代表性的实验相关数据及图表。
在新冠核酸检测过程中，在采用A扩增试剂时，质控品连续出现失控现象，如下图1~3所示：图1出现质控品ORF1ab靶标基因弱反应现象，图2、图3出现质控品ORF1ab靶标基因无反应。出于新冠核酸结果报告的时效性[1]，并保证结果能准时发放，实验室工作人员马上进行复查，重新开一支新质控品，将整批标本及质控重新提取、使用扩增时长较短的B试剂进行扩增，结果在控，如图4~5。
图3 2022042809当班工作人员在出现实验连续失控的现象后马上向实验室小组长反馈，小组长查看当天失控的实验结果，并对失控的原因进行分析。首先，连续失控的实验是由不同工作人员进行操作的，暂时可以排除人为操作因素导致的质控品失控现象；其次，要对实验耗材、仪器系统以及试剂和质控品本身的因素进行排查。通过查看近期试剂出入库记录发现，除了使用的第三方弱阳性质控更换批号外，其他耗材没有更换批号。进一步查看使用新批号质控后多批实验结果发现，使用新批次弱阳性质控品后，多次实验的质控结果的两个靶标基因Ct值比旧批号均有所升高，如图6~11（同为使用B扩增试剂对新旧批号质控品进行1：1稀释后进行实验的结果）。1.为进一步验证猜测，同时使用新旧批号的质控（原液）进行平行实验。
图12 20220428122.对新旧批号质控分别进行原液以及1:1稀释后进行两次平行实验查证，原液结果如图13，1:1稀释后结果如图14。
图13 2022042820-1
图14 2022042820-2由两次查证实验结果可见，新批号弱阳性质控两个靶标基因的Ct值不管是原液还是进行稀释后的结果均比旧批号有所升高。根据上述的验证实验结果，再进一步查看使用新批号质控品后的实验结果数据，初步怀疑是质控品本身的问题。由于不能完全排除人为操作因素，仍需要对耗材、仪器系统及试剂进行进一步的排查，所以结合实验室的全自动核酸提取及荧光PCR分析系统的实验结果进行对比（同为使用B扩增试剂对新旧批号质控品进行1：1稀释后进行实验的结果）。同样发现多次实验结果中的新批号质控品结果的两个靶标基因Ct值比旧批号质控品的结果均有所升高，由此可以排除人为操作、耗材、仪器系统及试剂的因素所导致的失控现象，同时也发现新批号质控不稳定，结果时强时弱，如图15~18所示。在一系列查验后证实是新批号质控品浓度下降，结合新批号质控使用前进行的换批验证是符合要求，推测是不同瓶质控间差异较大而导致质控品连续出现失控现象。随后跟厂家反馈，要求更换另一批号第三方弱阳性质控，暂停使用新批号质控。我实验室采用的旧批号质控品1：1稀释后的理想浓度约为所使用的扩增试剂最低检测限的1.5倍。理论上而言,弱阳性质控品浓度越接近最低检测限,检测的灵敏度越高。但由于新批号质控品浓度下降，不同瓶质控间差异较大，1:1稀释后浓度可能低于扩增试剂最低检测限，这可能会导致实验出现失控现象。有研究表明,浓度接近最低检测限的质控品的检测稳定性较低,易受核酸提取过程(如有机溶剂去除不彻底)、扩增过程(如仪器、试剂、孔间温度不均一性)、实验人员个体操作差异等问题影响,导致出现假阴性结果[2-4]。因此有建议称,核酸检测的弱阳性质控品浓度应为检测限的2～5倍[5]。按照《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》相关要求,使用的弱阳性质控品浓度通常为检出限的1.5～3倍[6]。回顾此次处理实验失控现象的过程，从出现失控到找到问题所在,用时不过短短一天。但通过查看此前实验的质控结果，发现早在前两天就出现问题。同样的现象，弱阳性质控两个靶标基因Ct值比以往有所上升，但此前并未引起大家的重视。有新同事在出现失控当天才发现新批号质控品已取出一盒开启使用，却并未及时出库。此时该盒新批号质控已经使用过半。1.新冠实验室里的工作虽忙碌紧张，但忙中要有序，小细节问题不容忽略。开启新批号耗材或试剂使用后忘记出库，看似不过是忽略一个工作上的小细节问题。但由于PCR实验的特殊性：耗时长、每一步环环相扣、新冠核酸检测有时限要求等，一旦某一环节出现问题，追溯起来却无迹可寻，只能整个实验流程一步步慢慢推敲，逐一排除原因。这不仅耗费大量人力物力，还可能会导致实验结果的延时发放。2.发现问题需及时反馈。实验室里人员众多，大家不是每天都会固定在一个岗位上工作。由于工作人员岗位替换、个别同事粗心大意等可能会出现一些或大或小的问题。实验室里的工作看似简单枯燥，但少不了要有一颗善于观察、发现问题的心。发现问题时与其他同事沟通，同时向小组长反馈，才能督促问题尽快解决。
参考文献
[1]《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）》
[2]李金明.实时荧光PCR技术.[M].北京科学出版社,2016：15.
[2]高维寅,张洪,罗阳.新型冠状病毒肺炎核酸检测中的假阴性分析及对策[J].
国际检验医学杂志，2020:1-8.http://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200304.1030.004.htmL.
[3]李振昊,高小玲,杨小娟,等.新型冠状病毒核酸检测分析[J].检验医学与临床,2020,17(10):1313-1315.
[4]蒋义,张钢,郭咚,等.血液病毒核酸筛查系统室内质控方法的建立及评价[J].临床检验杂志,2017,35(7):542-544.
[5]陈雪,李书平,赵欣,等.血液核酸筛查利用室内质控品Ct值建立质控图方法初探[J].中国输血杂志,2014,27(11):1154-1155.
[6]《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册(试行第二版)》
编辑：骆秉涵
