对许多药物来说，治疗选择仍然是一个反复尝试的过程，需要多次失败的试验才能在治疗反应和副作用之间达到可接受的平衡，这些药物反应的个体间差异对临床医生来说是一个挑战。1959年德国药理学家Friedrich Vogel提出遗传药理学（Pharmacogenetics）的概念，被定义为遗传对药物反应变化的研究[1]。1997年，Marshall引入了药物基因组学（Pharmacogenomics, PGx）的术语，意味着人们拥有评估整个基因组的知识和技术，可以研究多个基因对药物的影响[2]。2001年人类基因组草图的发布，是人类基因组计划成功的里程碑事件，拉开了人类基因组学研究和临床转化的大幕。这20年间，人类基因组信息的完成，以及新的基因分型和测序技术的出现，直接或间接性的引领多个领域和行业的快速发展。
遗传变异可由单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）、插入/缺失（Insertion/deletion，Indel）、拷贝数变异（Copy number variant，CNV）等引起，SNPs是基因多态性中最常见的类型，约占已知多态性的90%以上。其实多数SNPs似乎对基因功能没有明显影响，但是也有一些SNPs确实对相关基因的功能产生了深远的影响，无论是发生在基因的编码区，还是发生在距离转录起始位点较远的位置。人类基因组中已经鉴定出超过1400万个SNPs，超过6万个SNPs位于基因的编码区域[3]。在获得了人类基因组差异性的数据后，以DNA序列为基础的药物基因组学领域的研究在识别新变异方面更快，为我们提供了前所未有的机会来了解药物反应的多样性，也更好地解释了为什么每个人在疗效和毒性上对药物的反应不同。但建立起来从基因组测序数据到对应的临床表型之间的因果关系，需要大量临床研究进行综合评估，同时涉及的效用和成本效益分析也需要兼顾，因此真正的将精准用药融入临床治疗仍有较大的挑战。本文将个体化用药基因多态性的检测技术和临床应用的现状及前景进行综述。
一、常用的基因多态性检测技术
自2015年美国启动“精准医疗计划”，世界各国掀起了精准医疗热潮。其中基因检测技术的不断更新是推动精准医疗发展的关键。常用于基因多态性检测的方法包括实时荧光PCR法、荧光原位杂交法（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）、Sanger测序法、基因芯片法、高通量测序法、核酸质谱以及新兴的分子POCT检测技术平台等。1．实时荧光PCR法：实时荧光PCR法是指通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号进行实时监测从而实现对起始模板定性及定量分析[4]。根据检测原理的不同，实时荧光PCR法可分为探针法和荧光染料法两种。实时荧光PCR法因具有灵敏度高，分型准确，操作简便快捷，结果报告迅速，所用仪器容易普及，易于推广使用等特点，被广泛应用临床药物基因组的检测之中，如SNPs、Indel、CNV、基因表达的分析以及HLA-B分型检测等。截止到2021年5月31日，国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）已批准的药物基因组相关的第三类体外诊断试剂（In Vitro Diagnosis，IVD）中，接近2/3的产品（60/92）使用的是实时荧光PCR技术，涉及检测的基因包括CYP2C19、CYP2C9、CYP2D6、SLCO1B1、MTHFR、UGT1A1等（http://app1.nmpa.gov.cn）。2．FISH法：FISH法是20世纪80年代末在放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子生物学和细胞遗传学结合的新技术，是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。该方法利用已知DNA变异序列，与被检测的样本DNA序列杂交、互补配对，从而发现样本DNA的异常情况。在药物代谢酶和靶点基因检测中，FISH法主要用于测定基因扩增和基因缺失异常[5]。3．Sanger测序法：Sanger测序法也称直接测序、一代测序法，1977年由Sanger等发明，此后经过不断发展和改进，现今的Sanger测序技术已实现了自动化，采用四色荧光染料对ddNTP标记，毛细管电泳分离DNA片段，测序的便利性、安全性、通量均得到大大提高。Sanger法测序是DNA序列分析的经典方法，由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准[6]。Sanger测序法适用于SNP、短串联重复序列多态性（Short Tandem Repeats，STR）、Alu重复序列多态性以及HLA-B分型检测。目前，已有多个基于Sanger测序法的第三类IVD试剂通过了NMPA审批，涉及UGT1A1、ALDH2、MTHFR、CYP2C19、CYP2C9、VKORC1等基因位点的检测。4．基因芯片：基因芯片又称DNA芯片法，是以特定的寡核苷酸片段作为探针，将其按照一定的顺序固定于支持物上，然后将样品DNA通过PCR扩增、荧光标记等过程，按碱基互补配对的原理与芯片杂交，再通过荧光检测系统对荧光信号进行检测和分析，从而获得个体的基因型信息。该方法既可以进行SNP基因型分析，也可进行小至几kb的染色体拷贝数变异分析[7]。我国NMPA已批准多种用于药物代谢酶和药物作用靶点基因多态性检测的基因芯片试剂盒，如CYP2C9、CY2C19、CYP2D6、ADRB1、AVKORC1、IL28B、APOE、G6PD等。5、高通量测序法：高通量测序又被称为下一代测序（NGS）或大规模平行测序（MPS），是继Sanger测序的革命性进步，采用平行测序的理念，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标[8]。目前主流的商品化NGS技术主要有Illumina公司的Solexa技术和Thermo公司的Ion Torrent技术。高通量测序法主要的优点是可对目标进行高通量的检测，能同时进行SNP、CNV、STR、Alu、HLA-B分型检测；缺点是仪器贵重，试剂成本高，检测流程复杂，对实验室环境和操作人员的要求较高，数据分析难度大，不易于推广。主要适用于多个基因区域的基因变异的检测或低含量的突变检测等。6．核酸质谱技术：核酸质谱技术是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术原理，兼具PCR、芯片与质谱三大技术优势，是检测十几到几百个基因位点性价比较高的中通量基因检测技术[9]；比较成熟的核酸质谱平台为基纳（Agena Bioscience）公司的MassARRAY平台。核酸质谱技术分型准确，通量大，可进行多达30~40重的多重反应，可检测多等位基因SNPs，引物合成成本低；缺点是需要特殊的仪器设备，操作流程略显繁琐，多重反应体系设计难度高。该方法比较适合中低通量的SNP、甲基化的检测。7．分子POCT检测技术：分子POCT检测技术并不是一种特定的检测方法学平台，而是一种应用模式，强调检测产品的快速、轻便和易行。无论IVD产品基于何种方法学，只要其产品特性符合“小、快、灵”的特点，都可以纳入POCT的范畴。目前已被用于分子POCT检测的技术有胶体金层析、微流控芯片及小型一体化核酸检测平台等。国外POCT产品多采用集成式的一体化试剂盒，其开发技术门槛相对较高。而国内企业多采用一步法样本处理或者免提取等技术，减少人工操作流程，从而达到POCT的目的[10,11]。在用于药物代谢酶和药物作用靶点基因检测时，不同的技术方法都具有各自的优缺点，适用于不同的检测目标和应用场景。同时，随着科学发展与技术进步，一些新兴的技术不断出现，如RPA[12-14]、CRISPR-Cas[15-18]等，这些技术具有恒温扩增、灵敏度高、扩增效率高、检测时间短等特点，也必会在将来的基因检测领域发挥出重大的作用。
二、临床个体化用药的应用现状
1．Pharm GKB：药物基因学知识库（Pharmacogenomics Knowledgebase, Pharm GKB, www.pharmgkb.org/）对包含药理学信息的药物标签进行注释。这些信息已得到美国食品药品监督管理局（FDA）、欧洲药品管理局（EMA）、瑞士治疗产品管理局（swissmedicc）、加拿大卫生部（HCSC）及药品和医疗器械管理局日本（PMDA）的批准。截止到2021年5月，收录药物说明书409种，其中FDA 371种、EMA 140种、Swissmedic 131种、HCSC 109种、PMDA 52种。药物基因学知识库收录了临床药物遗传学实施联盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium, CPIC）、荷兰皇家药物促进协会-药物遗传学工作组（Dutch Pharmacogenetics Working Group, DPWG）、加拿大药物安全药物基因组学网络（Canadian Pharmacogenomics Network for Drug Safety, CPNDS）和其他专业协会发布的基于PGx的药物剂量推荐指南。Pharm GKB对配对的基因-药物临床注释证据进行分级，Level 1表示证据最强，Level 4证据最低，截止到2021年5月，1A级证据的药物有73个。因为药物遗传等位基因频率在不同种族人群之间存在显著差异，因此各个国家对于某个药物的分级也有不同。CPIC同样将证据等级分为A级（开处方时建议考虑基因信息）到D级（证据薄弱或存在相互矛盾），截至2021年5月，CPIC发布了26份指南，覆盖20个基因，超过65个药物，均为Level 1A证据级别。这些推荐可以作为药物基因检测临床实施的重要参考。但仍有许多药物，数据有限，不足以支持应用到临床实践中。这篇综述主要参考PharmGKB和CPIC指南进行描述。2．临床常用药物的个体化用药建议 ：药物基因组学的重点是识别影响药物治疗反应的基因变异，通常是通过改变药物动力学，即药物的吸收、分布、代谢或在药效学上通过改变其作用靶点和干扰影响患者对药物敏感性的生物途径而实现。（1）心脑血管药物：心血管疾病是我国发病率与死亡率最高的疾病，并呈逐年上升趋势[32]。随着药物基因组学得发展，个体化用药基因检测已广泛应用于心血管常见药物如抗血小板、抗凝血、抗高血压、他汀类和抗心律失常等药物的临床实践。氯吡格雷为前药，本身无活性，需经两步活化过程生成活性硫醇代谢物发挥抑制血小板聚集的作用，细胞色素P450酶（CYP）2C19、CYP3A4、CYP2B6、CYP1A2、CYP2B9、对氧磷酶1（PON1）和羧酸酯酶1（CES1）等代谢酶参与其活化过程，其中CYP2C19作为参与两个活化步骤的关键酶，对氯吡格雷的活化至关重要，CYP2C19基因多态性已被广泛用于氯吡格雷的临床前检测[33]。美国分子病理学协会（the US Association of Molecular Pathology）推荐检测CYP2C19*1-3和*17等位基因，根据不同星型等位基因变异组合而成的CYP2C19代谢酶活性大小指导是否选用氯吡格雷[34,35]。阿司匹林相关基因多态性检测证据较高的为HLA-DPB1基因检测，与阿司匹林所致哮喘风险相关[36]。CYP2D6基因编码的CYP2D6酶是机体重要的代谢酶之一，可参与目前经批准上市的21%的药物的代谢过程，如β-受体阻滞剂美托洛尔、钠通道阻滞剂氟卡尼和普罗帕酮等[37]。目前CYP2D6具有高度多态性的等位基因单倍型超过130个，如*1、*2、*33、*35为功能正常的等位基因，*9、*10、*17、*29、*36、*41是功能降低的等位基因，*3-8、*11-16、*19-21、*38、*40、*42为无功能等位基因[37]。大多数CYP2D6等位基因表现为SNPs或插入/缺失，也存在CNV和其他结构变异，其等位基因的缺失和重复在东亚人群中突变频率极低，一般不纳入临床检测[38]。心血管常用药物证据级别较高代谢酶还有CYP2C9，其基因多态性与苯妥英血药浓度及不良反应有关[39]。此外，转运蛋白和药物作用靶点的基因多态性同样是心血管常用药物临床选择及剂量调整的重要依据。证据级别较高的如溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B1（SLCO1B1）与ATP结合盒转运蛋白超家族成员2（ABCG2）作为药物转运蛋白，可诱导血浆药物浓度的变化，其基因多态性是对他汀类药物反应的重要预测因子[40, 41]。驱动蛋白分子6（KIF6）和载脂蛋白E（ApoE）参与动脉粥样硬化的病理生理过程，其基因多态性导致个体间他汀类药物药效的差异[42, 43]。维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）和血管紧张素转化酶（ACE）分别作为华法林与卡托普利的作用靶点，其基因多态性与药物的剂量调整密切相关[44, 45]。目前心血管常见药物基因检测已经被广泛应用于PCI术后氯吡格雷有效性预测、华法林剂量调整及他汀类药物耐受性选择等临床实践，大量研究聚焦于发现可预测心血管常用药物PK/PD的生物标志物，但由于证据级别较低，仍需要多中心、大样本随机对照实验的验证。（2）免疫抑制药：目前常用的免疫抑制类药物主要包括他克莫司（Tacrolimus, TAC）、环孢素（Cyclosporine, CsA）、西罗莫司（Sirolimus, SIR）、糖皮质激素类药物（glucocorticoids）、吗替麦考酚酯（Mycophenolate mofetil, MMF）、硫唑嘌呤（Azathioprine, AZA）等，其代谢存在明显的个体差异，这与不同个体药物代谢相关基因的差异有密切关系。AZA是目前FDA要求检测的唯一一个免疫抑制药。TPMT和NUDT15基因的多态性与AZA导致的骨髓抑制关系较为明确，证据等级较高[46]。而对于亚洲人群来说，NUDT15功能缺失等位基因的突变频率远高于TPMT[47]，更具参考价值。遗传差异如CYP3A5和CYP3A4单核苷酸多态性是导致TAC应用个体差异最主要的原因，可以解释56~59％的TAC剂量和清除率的变异性[48,49]。CsA药物基因组学研究较TAC少，主要集中在ABCB1和CYP3A5[50,51]。研究报道SIR和依维莫司的PK和不良反应可能与CYP3A5、ABCB1、CYP3A4的多态性有关[52,53]，与MMF 的PK/PD和不良反应有关的基因有IMPDH2、UGT1A8、ABCB1、IL10等[54]，但这些证据的推荐级别较低，也无明确的推荐意见，需要进行更深入的研究，以确认其临床价值。但是这类药物大部分可以通过TDM进行有效地监测，以帮助临床医生更合理用药。（3）神经精神类药物：神经精神类药物代谢相关基因的遗传变异，对抗精神疾病药物的选择及剂量调整有重要作用，以增强治疗效果，降低不良反应。CPIC、DPWG、CPNDS等研究机构对部分抗精神失常药物给出了个体化用药建议[55-58]，根据基因型预测同时结合TDM调整剂量，对于长期服药的患者尤为适用。目前证据级别比较高相关基因集中在CYP2D6、CYP2C19、HLA-B等。目前CYP2D6具有高度多态性的等位基因很多，变异形式多样，这样的情况导致该基因的临床检测和分析较为困难。尽管CPIC对14个抗精神失常药物进行剂量推荐，但是并没有要求需要检测哪些等位基因，也增加各个实验室之间检测的内容有差异[38]。丙戊酸是常用的情绪稳定剂和抗癫痫药物，目前FDA 建议使用丙戊酸前应进行 POLG 基因检测，并禁止对发生 POLG 基因突变的患者使用丙戊酸[59]，但是该基因在中国人群中的突变频率较低。卡马西平、奥卡西平和苯妥英的不良反应与HLA-B *15:02:01相关，HLA-B *15:02:01阳性患者使用此类药物可能会引发严重的皮肤过敏反应，如 Stevens Johnson综合征（SJS）和中毒性表皮坏死溶解症（TEN）。亚洲人特别是中国人中HLA-B *15:02:01的携带者约有 10%~15% ，建议在用药前进行该基因检测[60,61]。此外HLA-A *31:01:02携带者发生卡马西平所致严重皮肤反应的风险增高，除非获益大于风险，否则避免使用。（4）抗肿瘤药物：本次主要介绍临床使用比较广泛的传统化疗药物，如伊立替康，甲氨蝶呤，他莫昔芬，氟尿嘧啶等，对于新型的靶向抗肿瘤药物并未涉及。此类药物的不良反应及药物代谢方面都存在明显的个体差异，这与个体间药物基因型不同有关。伊立替康（CTP-11）是临床上晚期大肠癌的一线用药，对肺癌、乳腺癌、胰腺癌等也有一定疗效。对于使用CPT-11化疗的亚洲人群，UGT1A1*6、*28基因突变纯合型患者发生腹泻和中性粒细胞减少的风险最高，其次为突变杂合型，而野生型最低[62]。2019年中国临床肿瘤学会（CSCO）相关指南也指出，UGT1A1*6、*28纯合突变型或双杂合突变型肿瘤患者应减少CPT-11剂量，以降低不良反应发生的风险[63]。他莫昔芬（TAM）作为乳腺癌内分泌治疗的一线药物，关于其基因多态性的研究集中在CYP3A4、CYP3A5、CYP2D6、CYP2C19、SULT1A1等，其中以CYP2D6的证据级别最高，与疾病复发可能性有关，但目前并没有写入临床指南 [64-65]。氟尿嘧啶（FU）基因多态性的研究大多聚焦于预测其疗效或不良反应的基因，包括DPYD、TYMS、MTHFR、GSTP1等。虽然DPYD证据级别最高，与FU不良反应的发生率密切相关，但是中国人群的突变率极低，而突变率较高的DPYD rs1801159无典型的临床意义[66-67]。甲氨蝶呤代谢通路上的相关基因非常多，主要关注亚甲基四氢叶酸（methylene tetrahydrofolate reductase, MTHFR）还原酶编码基因MTHFR C677T 和 A1298T的基因多态性[68-69]，其临床指导意义有限，非常有必要结合甲氨蝶呤24h、48h、72h的TDM结果及时解救处理。ABCC2、ABCC6和ACSS2与多西他赛的代谢和毒性相关，但证据级别较低。对于这些药物可以通过TDM进行浓度和疗效的监测，更好地辅助临床，促进合理用药及个体化治疗。（5）其他：除上述药物外，伏立康唑的代谢的PK参数与CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17密切相关[70]。奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑的疗效和代谢亦受到CYP2C19*1, CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17基因多态性的影响[71]。塞来昔布、氯诺西康、美诺西康的代谢差异可由CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3基因多态性来解释[72]。麻醉类药物地氟醚、安氟醚、氟烷，异氟醚、七氟醚等毒性与RYR1基因多态性有关[73,74]。别嘌呤醇可引起严重的可能致命皮肤不良反应，台湾研究者率先证明了HLA-B*5801等位基因与别嘌呤醇诱导的SJS和TEN的发生相关。美国风湿病学会 (ACR) 建议东南亚和非裔美国人在使用别嘌呤醇治疗前，应检测HLA-B*5801等位基因[75]。中国汉族人群HLA-B*5801的基因频率约为6.00%，用药前进行HLA-B*5801等位基因阳性筛查是比较有意义。
三、临床个体化用药的局限性及应用前景
人类全基因组序列的获得，使分析人类基因组序列变化对重大疾病发病机制和药物治疗反应的影响成为可能。尽管药物标签纳入相关药物遗传信息和建议，大量临床研究提供了基因型和药物反应之间的因果关系，但并未让临床医生满意。此外，一些药物基因组学的研究仍无法转化至临床实践。依然面临诸多的影响因素，比如检测费用较高，缺少个体化用药建议，临床医生对基因变异解读的能力有限，缺少基于基因组学的临床决策支持系统，高质量的临床研究较少等[76-78]。随着基因组检测技术和分析方法的进步，从群体未知的全基因组数据中，找到对应的药物反应表型并作验证是比较困难的过程。而且一个特定药物在临床中受多个基因调控，一个基因可以影响多个药物，单个SNP可能不足以将目标蛋白的变化与疾病或药物反应联系起来，因此，检测含多个药物基因变异的panel，适用于服用多个药物的患者，如老年人。但是这样的检测手段目前并不普遍，一是需要建立多个基因位点的效应模型，依据权重计算评分，更科学地出具个体化用药建议，二是需要进行药物遗传变异检测的成本-效益分析，以充分衡量药物基因检测实施的可行性，并希望促进更广泛的报销制度。然而随着基因分型检测成本的快速下降，许多成本-效益研究很快便无参考价值。相对于基因检测，TDM单次检测费用较低，且更容易实现操作，因此根据TDM进行剂量调整比获得基因分型更易接受。药物基因组学并不是药物反应的唯一决定因素，必须将人口因素、环境因素、临床生理病理状态等考虑在内，只有对所有因素进行综合评估，才可以成功地实现个体化药物治疗。同时利用信息化支撑的数据库，不停地进行机器学习，形成临床决策支持系统，满足临床医生的要求。
近年来多“组学”的发展提高了人们预测疾病和药物反应、精准诊疗的能力。药物基因组学是多组学技术研究之一，集中在基于DNA测序数据解读遗传信息和药物PK/PD之间的关系，如果在全基因组关联研究中整合转录组学、蛋白质组学、表观遗传学和代谢组学可能有助于识别与多因素疾病和药物反应相关的易感遗传因素，针对易感人群进行早期干预，促进药物达到疗效最大化和毒副作用最小化，实现安全、有效、低成本的个体化药物治疗，共同促进人类健康。
