临床实验室核酸污染处理方法的研究
摘 要:本文以新型冠状病毒核酸检测实验室为例,探讨了75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液对实验室各种污染源、污染方式的清除效果。结果显示,酒精及含氯溶液对于污染的清除效果较弱,使用核酸清洗液可以有效的清除各类污染,且核酸清洗液没有含氯溶液腐蚀性的缺点,是分子生物学实验室较为理想的污染处理方法。
关键词:分子生物学实验室;新型冠状病毒;污染;核酸清洗液
2019年末,新型冠状病毒2019-nCoV被首次发现感染人类,随后2020年新冠疫情在全球爆发。在疫情防控方面,新型冠状病毒核酸检测是发现、确诊感染病例的有效手段。近两年来,随着疫情防控不断升级,全国各地建立了一大批分子生物学检测实验室,有效缓解了核酸检测压力。但是,由于检测实验室长时间运转、强阳性样本气溶胶污染、操作员操作不规范等各种原因,实验室污染的现象频频发生。实验室发生污染以后,轻则重新进行检测,重则实验室停止运转,必须等污染消除后才能继续使用。因此,亟需寻找一种有效的去除分子生物学实验室核酸污染方法。 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种用于放大扩增特定的核酸片段的分子生物学技术,该技术于1985年被美国Kary Mullis等人发明[1]。PCR具有灵敏度高、简单快速、特异性好的优点,在新型冠状病毒检测方面,相较于抗原检测,PCR检测具有提前发现感染者、准确度高的巨大优势,因此,PCR检测是新型冠状病毒检测的金标准[2]。由于PCR技术的灵敏度极高[3],一旦发生实验室污染,就会导致假阳性的发生,这对于分子生物学检测实验室来说是及其致命的。一般分子生物学实验室的污染来源于以下几个方面:第一,强阳性样本气溶胶污染;第二,检测试剂盒内阳性质控品污染;第三,PCR产物气溶胶污染[4]。目前,处理实验室污染,一般采用含氯消毒剂喷洒、酒精擦拭和紫外灯照射处理的方法[5],但是,含氯消毒剂具有较强的腐蚀性,不能处理仪器设备,酒精又有发生火灾的隐患,紫外照射只能将长片段核酸降解成短片段,不能完全降解核酸,对于长度为100~200 bp的PCR产物污染,紫外照射的效果收效甚微。本实验通过对比75%酒精、新型核酸清洗液以及含氯溶液处理的方法,评估各处理方法对试剂盒阳性对照、PCR产物的清除效果,以期为分子生物学实验室的污染处理提供新的有效方法。 主要试剂与仪器见表1。 表1主要试剂与仪器及厂家 使用核酸提取或纯化试剂提取核酸检测试剂盒中的阳性对照,并按照说明书要求将阳性对照进行扩增,获得PCR产物。将PCR产物于产物分析室稀释10000倍备用。 使用核酸提取或纯化试剂将核酸检测试剂盒阳性对照、稀释后的PCR产物纯化为核酸溶液,各取10 μL于1.5 mL离心管中,分别加入200 μL TE Buffer(对照组)、浓度为2000 mg/L的含氯溶液(实验组1)、75%酒精(实验组2)和核酸清洗液(实验组3),混匀后室温反应15 min,随后使用核酸提取或纯化试剂纯化为待检样本,用于下一步PCR检测。 根据核酸检测试剂盒说明书,取待测样本20 μL加入至20 μL反应液中,体积共40 μL,按照说明书反应条件进行检测,对比实验结果。 使用核酸提取或纯化试剂提取核酸检测试剂盒中的阳性对照,并按照说明书要求将阳性对照进行扩增,获得PCR产物。将PCR产物于产物分析室稀释10000倍备用。 使用核酸提取或纯化试剂将核酸检测试剂盒阳性对照、稀释后的PCR产物纯化为核酸溶液,各取10 μL滴于咽拭子上,将咽拭子固定并放置于实验室传递窗内,使用喷壶对准拭子喷洒TE Buffer(对照组)或核酸清洗液(实验组),15 min后将拭子取出,置于TE Buffer内,剧烈震荡使拭子附着物溶于TE Buffer内,随后将TE Buffer添加至核酸提取或纯化试剂进行核酸提取纯化为待检样本,用于下一步PCR检测。 通过不同处理方法对阳性对照和PCR产物处理后,核酸纯化并进行检测。 如图1(a)所示,阳性对照ORF1ab基因片段经处理后,对照组、实验组1、实验组2均出现了扩增,实验组3无扩增。同时,对照组、实验组1和实验组2的CT值相差不大;如图1(b)所示,阳性对照N基因片段被不同方式处理后,表现出与ORF1ab基因同样的效果。结果表明,含氯溶液和75%酒精在短时间内对于RNA的降解是有限的,而核酸清洗液可以有效地去除阳性对照中的RNA片段。 图1. 阳性对照不同方式处理后检测结果 如图2(a)所示,PCR产物中ORF1ab基因产物片段经处理后,对照组、实验组1、实验组2均出现了扩增,实验组3无扩增。同时,对照组、实验组1和实验组2的CT值相差不大;如图2(b)所示,PCR产物N基因产物片段被不同方式处理后,表现出与ORF1ab基因同样的效果。结果表明,含氯溶液和75%酒精在短时间内对于DNA的降解是有限的,而核酸清洗液可以有效地去除PCR产物中的DNA片段。 图2. PCR产物不同方式处理后检测结果 通过喷洒不同液体对阳性对照和PCR产物进行处理,随后核酸纯化并进行检测。 如图3(a)所示,阳性对照ORF1ab基因片段经处理后,对照组有明显扩增,而实验组无扩增曲线;同样的,如3(b)所示,N基因经处理后有同样的表现。这说明核酸清洗液通过喷洒的方式可以达到消除RNA污染的目的。 图3. 阳性对照经核酸清洗液喷洒后的检测结果 如图4(a)所示,PCR产物ORF1ab基因产物片段经处理后,对照组有明显扩增,而实验组无扩增曲线;同样的,如4(b)所示,N基因产物片段经处理后有同样的表现。这说明核酸清洗液通过喷洒的方式可以达到消除DNA污染的目的。1.1试剂与仪器
1.2实验方法
1.2.1不同处理方法对核酸处理效果检测
1.2.2核酸清洗液喷洒对核酸处理效果检测
2.1不同处理方法对核酸处理效果检测
2.2核酸清洗液喷洒对核酸处理效果检测