贾彦生 戴二黑：DNA甲基化与肿瘤的关系及在肝癌诊疗中的临床意义

1.DNA甲基化介绍：DNA甲基化是真核生物中相对保守且研究较为清楚的表观遗传修饰机制之一。它是通过DNA甲基转移酶（DNMT）家族催化，将甲基从S-腺苷酸甲硫氨酸（SAM）转移到胞嘧啶残基的第五个碳上形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)。DNMT3A和DNMT3B可以对未修饰的DNA建立新的甲基化模式，对于胚胎的发育和肿瘤的发生发展有着重要作用。DNMT1主要是在DNA复制过程中发挥作用，将甲基化状态DNA从亲代DNA链复制到新合成的子链DNA上。DNMT2是以一种tRNA的甲基转移酶。DNA 甲基化主要发生在 CpG 岛的胞嘧啶上，基因组中大约70%的CpG岛区域处于甲基化状态。研究发现，对于一些活跃表达的基因，它们的启动子区域通常是去甲基化的，而沉默基因的启动子区甲基化现象较为严重。另一方面，当细胞不再分化或者分化能力减弱时，甲基转移酶的表达就会大大减少。这一定程度上也表明了有丝分裂后细胞中的DNA甲基化状态是稳定的。然而，在成熟哺乳动物的大脑中，有丝分裂后神经元仍然可以表达大量的DNMT，这增加了DNMT和DNA甲基化可能在大脑中发挥新作用的可能性。DNA甲基化对于沉默逆转录病毒元件、调节组织特异性基因表达、基因组印记和X染色体失活等至关重要。而且，不同基因组区域的DNA甲基化可能根据潜在的遗传序列对基因活动产生不同的影响。   

CpG岛是长度约为1000个碱基对的基因序列，它的密度高于基因组的其他部分。CpG岛在进化上是保守的，通过调节染色质结构和转录因子结合来促进基因表达。大多数基因启动子位于CpG岛内，CpG岛占所有启动子的50%以上，可在发育过程中甲基化，并促进长期的基因沉默，如X染色体和印迹基因失活。特别是，管家基因的启动子通常嵌入CpG岛中。CpG岛的甲基化可阻止转录因子结合，招募抑制性甲基结合蛋白，稳定沉默基因的表达。然而，有些CpG岛，特别是那些与基因启动子相关的岛，很少被甲基化。这就需要进一步的研究来确定CpG岛的DNA甲基化在多大程度上调节基因表达。

2.DNA甲基化的基本机制：DNA甲基化的机制包括甲基化和去甲基化。涉及到不同的作用机制。在甲基化过程中发挥作用的主要是DNA甲基转移酶（DNMT）。主要涉及到前面提到的DNMT家族的三个成员即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，它们直接催化甲基加成到DNA上。DNMT1可以与新合成的DNA结合并使其甲基化，以精确模拟DNA复制前存在的原始甲基化状态。此外，它还具有修复DNA甲基化的能力。DNMT3A和DNMT3B在结构和功能上极为相似。它们的主要区别在于其基因表达水平不同。DNMT3A的表达相对普遍，但DNMT3B在除甲状腺、睾丸和骨髓外的大多数分化组织中表达相对较差。3B在早期发育过程中是必需的，而3A是正常细胞分化所必需的。另外此家族还有最后一个成员是DNMT3L。它主要是在机体发育早期表达，成年后仅表达于生殖细胞和胸腺。尽管DNMT3L本身没有催化功能，但它与DNMT3A和DNMT3B结合并刺激它们的甲基转移酶活性。与小鼠早期发育和生殖细胞中存在的DNMT3L相一致，DNMT3L是建立母系和父系基因组印记、甲基化逆转录转座子和压缩X染色体所必需的。

DNA的去甲基化过程可以是被动的，也可以是主动的。被动DNA去甲基化发生在分裂的细胞中。由于DNMT1在细胞复制过程中积极维持DNA甲基化，其抑制或功能障碍可以使新加入的胞嘧啶保持非甲基化，从而降低每个细胞分裂后的总体甲基化水平。主动的DNA去甲基化可以发生在分裂细胞和非分裂细胞中，但该过程需要酶促反应来处理5mC，形成5hmC。到目前为止，在哺乳动物细胞中还没有已知的机制可以切断连接胞嘧啶和甲基之间的强共价碳-碳键。相反，去甲基化是通过一系列化学反应发生的，这些化学反应进一步修饰5mC，通过脱氨基和/或氧化反应生成一种产物，该产物被碱基切除修复（BER）途径识别，以裸胞嘧啶取代修饰的碱基。尽管普遍认为BER途径是DNA去甲基化的最后一步，但DNA去甲基化过程中形成的特定酶和化学中间体仍存在争议。另外，还有一种活跃的DNA去甲基化机制被发现是由TET酶介导，TET酶家族有TET1、TET2和TET3组成。TET酶在5mC的甲基上添加一个羟基，形成5hmC。一旦5hmC形成，哺乳动物体内有两种不同的机制可以将5hmC转化回胞嘧啶。第一种是TET酶的反复氧化先将5hmC氧化为5-甲酰基胞嘧啶，然后再氧化为5-羧基胞嘧啶。第二种情况是5hmC被AID/APOBEC脱氨基，形成5-羟甲基尿嘧啶。总之，主动的DNA去甲基化过程可能会涉及到多种酶的多种途径，这种复杂性还有待进一步研究。

02 DNA甲基化与癌症的关系

众所周知，在生物体中适当的DNA甲基化对于正常的细胞功能和机体发育至关重要。但是当甲基化过程出现任何异常都可能导致各种疾病的发生，其中包括难以治愈的癌症。研究发现肿瘤细胞基因组中的DNA甲基化区别与正常的细胞基因组，因为在癌症中可以观察到低甲基化和高甲基化水平。某些肿瘤抑制基因的失活是由于启动子区域内的高甲基化而发生，大量研究表明，在不同类型的癌症中，DNA甲基化导致了广泛的基因沉默，DNA甲基化发生的位置恰恰是在正常组织中肿瘤抑制因子的基因序列中。另一方面，导致基因组不稳定的低甲基化有助于癌细胞的转化，低甲基化意味着甲基化程度低于正常细胞，低甲基化数量的增加被证明能激活癌基因，并影响染色体的稳定性和一些逆转录转座子元件。例如，在腹膜间皮瘤中被证实DNA处于高甲基化状态，而肺癌中的Alu和LINE1后转座子处于低甲基化水平。除了启动子区域和重复DNA序列中的DNA甲基化改变外，这种现象还与非编码RNA（如可能在肿瘤中起抑制作用的microRNA）的表达调控有关。

1.癌症中的DNA高甲基化：在肿瘤疾病中，尽管从基因组总体水平来说处于低甲基化状态，但某些基因由于调控区CGI高度富集进而发生甲基化而失活，而非恶性组织中则CGI区域未发生甲基化。这种现象首先是在视网膜母细胞瘤患者的研究中得以证实，研究发现视网膜母细胞瘤中肿瘤抑制基因（RB1）启动子处于高甲基化。后来陆续发现在其它肿瘤组织中有着大量DNA处于高甲基化水平而沉默的肿瘤抑制基因。

处于调控区域的基因发生高甲基化会涉及到多条重要的细胞途径。与细胞周期相关的两个基因p16 INK4a和P15 INK4a是重要的肿瘤抑制因子，作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂在细胞G1期发挥关键作用。但是在不同类型的肿瘤中却可以通过基因甲基化而介导沉默。CDH1和CDH13基因主要参与细胞的粘附，它们的高甲基化沉默可能导致癌细胞的侵袭和转移，从而导致肿瘤的发生发展。同样癌症中的一些高甲基化基因与癌细胞的存活有关，因为它们具有促凋亡功能。例如，死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）可以介导干扰素诱导的凋亡或TMS1激活的凋亡信号通路。同样DNA高甲基化也会影响到许多细胞生理过程中上游调节相关基因的表达，如转录因子GATA5和信号通路因子RARB2基因在癌症中通常处于高甲基化水平。

如上研究都证实了异常的CGI甲基化可以通过影响细胞过程中涉及到的基因而促进癌症的发展和进展。值得注意是，最近的一些研究发现启动子的甲基化可能是癌细胞特异性的。此外，DNA甲基化水平的差异可能反映出肿瘤发生的阶段，甚至可以区分特定的组织学特征。随着研究的深入，被DNA甲基化沉默的基因数量正在不断增加，但它们在肿瘤发生过程中如何获得高甲基化目前仍不清楚。当下的研究更倾向于非随机DNA甲基化过程的假设。相信随着研究的深入，高甲基化发生的机制会越来越清晰。

2. 癌症中的DNA低甲基化：在正常细胞中，着丝粒周围异染色质发生高度甲基化，沉默卫星序列和重复基因组序列基因的表达，从而确保基因组的完整性和稳定性。然而，在许多肿瘤中，这种机制得到破坏，失活区域的DNA发生去甲基化。因此，加大了有丝分裂重组的可能性。随后重新激活转座因子，导致基因突变和基因组不稳定。这可能与肿瘤的发展有关，也可能与疾病的不同阶段有关。DNA去甲基化可能激活基因组中的潜在病毒序列，进而促进肿瘤发生。如生殖道人乳头瘤病毒（HPV）的基因组在感染后被CpG甲基化有效抑制。而一旦DNA去甲基化则HPV会再表达，并伴随着宫颈癌的发生发展。癌细胞中发生单个基因的去DNA甲基化是比较少见的。受DNA甲基化缺失影响的大多数启动子属于组织特异性基因。例如，在黑色素瘤和结直肠癌中，黑色素瘤相关的CT抗原MAGE被启动子区域的DNA低甲基化而重新激活。

3.癌症中的DNA甲基化生物标记物：DNA甲基化作为肿瘤生物标志物不仅对于癌症的早期诊断，而且对于预后、治疗及预测、监测术后复发风险等都是不可或缺的。DNA相对来说比较稳定，通过特异性的引物进行PCR反应很容易从不同种类的物质中分离出来，并且进行分析时需要的量较少。肿瘤抑制基因（如GSTP1、CDH1和RAR-b2等）中启动子区域的高甲基化会影响它们的活性，使基因转录沉默，并影响癌症信号的传导。因此，癌症基因的异常甲基化可以作为癌症早期检测和预测的生物标志物。越来越多的研究者致力于鉴定诊断性DNA甲基化生物标记物，其中包括波形蛋白、syndecan2、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）和SHOX2等。目前比较明确的是NDRG4和BMP3基因甲基化可以作为结直肠癌的生物标记物；配对同源结构域2（PITX2）启动子的DNA甲基化状态被认为是乳腺癌、前列腺癌和肺癌的候选生物标志物，并且与患者预后不良及术后复发风险增加相关；SHOX2甲基化在检测肺癌的血浆中具有较高的敏感性（60%）和特异性（90%），可以作为肺癌的生物标志物。

DNA甲基化作为生物标记物的优点之一是易于检测和分析。而且由于DNA可以从肿瘤组织中释放出来，因此可以从生物液体中检测甲基化基因。以非侵入性方式获得的痰、血浆、血清及尿液等样本中基于DNA甲基化的生物标记物的鉴定可能是早期检测癌症的有效手段。然而，选择合适的技术进行临床检测应用仍然是一个有待解决的问题。

03 DNA甲基化与肝癌的研究

肝细胞癌（HCC）作为一种侵袭性很强的恶性肿瘤，已经成为全球第二大致死性癌症。肝癌是许多国家面临的一个公共卫生问题，因为它具有高度的侵袭性和较低的生存率，而且起病不易发现、病因复杂。肝细胞癌一般是原发性肝癌，占所有肝癌病例的90%。我国每年肝癌的死亡率约占全球的50%以上，已经严重危害到我国居民的生命健康。肝癌发生最重要的危险因素包括吸烟、酒精诱导、饮食中含有黄曲霉毒素、肝硬化、代谢紊乱以及乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）引起的慢性感染。在多数情况下，肝炎、肝硬化或纤维化是肝细胞癌发生的重要背景。另外，由于糖尿病和肥胖等相关风险因素的增加，使得许多国家的肝癌发病率仍在继续上升。通常，肿瘤细胞具有高度的抗内环境稳定特性，使其能够逃避治疗和易于转移。因此，由于缺乏明显的早期临床特征和没有高效的生物标志物及有效的治疗，导致肝癌患者治疗效果不佳、预后差、死亡率高。因此，寻找合适的肝癌诊断和治疗方法是一个迫切需要解决的问题，深入了解肝癌的发病机制是提高预防和治疗水平的关键。

大量研究表明，基因表达的调控失衡和异常的分子信号传导是癌细胞生存的优势，是癌症发生的关键标志。表观遗传学改变中的不良变化会增强癌细胞的选择优势。肝脏作为不断适应高度多变环境条件的器官之一表现出对环境极为敏感，如机体由于病毒性肝炎引起损伤、过量饮酒和肥胖等都会导致表观基因组紊乱。表观基因组的改变，包括染色质修饰、miRNAs、LncRNAs以及DNA甲基化等都会推动不受控制的细胞生长和增殖、侵袭和转移，以及肝脏从慢性肝炎、肝纤维化慢慢积累到肝癌的发生。

为了研究HCC肿瘤中全基因组DNA甲基化异常表达是否与丙HCV相关，Shen等人使用Infinium Human甲基化450K BeadChip阵列检测了66对HCC肿瘤和邻近癌旁组织的全基因组DNA甲基化状态。结果发现低甲基化CpG位点的数量百分比（79%）明显高于高甲基化位点（21%），这与主要发生在大陆架地区的低甲基化CpG位点相比，高甲基化CpG位点更常见于CpG岛屿和海岸。更重要的是，还发现有75个CpG位点与性别显著相关；56个HCV感染与肝硬化相关；228个异常甲基化的CpG位点与HCV感染有关，其中包括147个与HCV感染密切相关的基因。有意思的是，在HCV和HCC中没有发现重叠的CpG位点，这意味着HCV相关的甲基化CpG位点独立于HCC的发展。在另一项针对69对配对HCC肿瘤和癌旁组织的全基因组DNA甲基化谱研究分析中，Gentilini等人使用不同的方法，观察到从正常肝、癌周组织到HCC组织的随机表观遗传突变（SEM）数量逐渐增加，HCC组织的SEM中位数比正常肝组织高13倍。此外，通过分析SEM在肝癌和癌周组织中的基因组位置，发现了四个参与表观遗传调控的候选基因，包括AJAP1、ADARB2、PTPRN2和SDK1。Hama等人最近对373例肝癌标本的全基因组进行了亚硫酸氢盐测序、全基因组鸟枪测序、长阅读测序和病毒捕获测序，去分析表观遗传学特征和遗传畸变之间的相关性。结果显示体细胞突变可能优先发生在非肝癌基因组的高度甲基化区域，表明染色质状态可能调节肝癌基因组中体细胞突变的频率。综合分析结果提供了肝癌遗传、病毒和表观遗传改变之间相互依赖的证据。

04 DNA甲基化与肝癌的临床诊断及预后

慢性HBV感染是全球性的公共卫生问题，由于患者数量多，进而转化为肝癌患者的数量也在不断增加。目前，血清甲胎蛋白（AFP）在肝癌的筛查、诊断、临床表现和评估中发挥着重要作用，是应用最广泛的肝癌血清生物标志物。然而，其临床应用方面还存在着较大的争议性，对早期临床诊断肝癌的敏感性并不高。因为不仅肝癌，像慢性肝炎和肝硬化患者的血清中AFP也会升高，常常导致误诊。不过，随着科技的进步和对于肝癌遗传学与表观遗传学深入的研究发现，肝癌的DNA甲基化生物标志物有助于提高肝癌诊断和预后的准确性。

DNA甲基化检测方法多是基于聚合酶链式反应的技术。正如前面提到的，DNA测序作为目前常用的一项技术，包括亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、基于甲基-CpG结合域的捕获，其次是高通量测序（MBDCap-seq），以及定量等位基因特异性实时靶点和信号放大分析）。从基因组中筛选基因异常甲基化状态时，使用Illumina BeadChip和MEXPRESS平台分析DNA甲基化。此外，基于多学科多领域交叉研发的甲基化检测方法也在陆续使用，如利用半导体技术对基于DNA甲基化的生物标记物进行电检测，显示了早期癌症筛查的巨大前景。在肝癌的检测和诊断中，能够根据患者的样本类型和检测目的选择合适的甲基化检测方法非常重要。针对不同的肝癌样本使用不同的检测方法，肝癌的甲基化生物标志物选择也会有很大的不同。

1.肝癌组织中用于诊断和预后的DNA甲基化生物标记物：Yu等人收集了60例肝癌组织和癌旁组织，并应用qRT-PCR方法、亚硫酸氢盐测序、免疫组织化学和Western blot等方法检测DEUP1启动子的甲基化状态，并分析其与临床病理数据的相关性。结果表明，与肝癌组织相比，癌旁非肿瘤组织中DEUP1的mRNA和蛋白表达显著增加。在46/60（76.7%）的肿瘤组织中检测到DEUP1启动子甲基化，并且启动子甲基化与DEUP1蛋白表达呈负相关（P<0.05）。临床病理数据分析显示，DEUP1的mRNA和蛋白表达及其启动子甲基化状态与肝癌淋巴结转移分期和肿瘤分化显著有关。因此，DEUP1启动子的甲基化可能是基因失活的一个重要机制，在肝癌的发生和发展中起着关键作用。胞嘧啶第五位（5 mC）的甲基化是DNA重要的表观遗传修饰。研究表明，5mC的氧化衍生物，即5-羟甲基胞嘧啶（5 hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5 fC）和5-羧基胞嘧啶（5 caC），是动态存在的，具有不同的调节功能。在肝细胞癌早期，总5 hmC和5 fC含量明显降低；5 hmC和5fC的减少主要是由于5mC的减少，并与HBV感染、TET酶活性降低以及DNA甲基化相关酶的不协调表达有关。此外，最近的研究表明，全基因组5 hmC水平在肝癌组织和细胞系中下调，5 hmC也可能是一种新的肝癌预后生物标志物。分析基于微阵列和RNA测序数据的肝癌组织中含伴侣蛋白的T复合物1亚单位3（CCT3）的表达谱。根据来自癌症基因组图谱（TCGA）的421个样本（HCC，n=371；非HCC，n=50）和来自31个微阵列或RNA测序数据集的3851个样本（HCC，n=1975；非肿瘤=1876），提取并检测CCT3表达水平。采用了多元分析方法，包括SMD森林图、敏感性分析、亚组分析和sROC曲线，以确认最终结果。根据临床病理参数（如种族、家族史和组织学分级）分组时，各组间CCT3的表达也不同。他们的研究对肝癌进行分期和预后分析，提示CCT3可能在HCC的发生、发展中起重要作用，对HCC有一定的预后价值。此外，CCT3可能是肝癌的一个有希望的生物标志物。甲氨基转移酶环脱氨酶（FTCD）是肝癌的候选抑癌基因。采用癌症基因组图谱（TCGA）和60例HCC患者队列分析FTCD在肝癌组织中的表达和临床相关性。访问MEXPRESS平台以确定启动子区域FTCD中的甲基化水平。结果显示FTCD在肝癌组织和细胞系中表达明显下调。低FTCD表达与不良预后（P<0.001）和侵袭性肿瘤表型相关，包括AFP水平（P=0.009）、肿瘤大小（P=0.013）、血管浸润（P=0.001）、BCLC分期（P=0.024）和pTNM分期（P<0.001）。生物信息学分析表明，启动子甲基化可导致FTCD表达降低。FTCD在HCC的发病和进展中起着抑癌基因的作用，是HCC的候选预后标志物和可能的治疗靶点。在研究酸性磷酸酶基因座1（ACP1）、骨形态发生蛋白4（BMP4）和睾丸特异性蛋白Y编码样5（TSPYL5）的甲基化水平与肝癌患者的临床病理特征和预后的关系时，发现ACP1、BMP4和TSPYL5的高甲基化在HCC中是普遍存在的，可作为HCC组织中潜在的可检测生物标志物。此外，BMP4还可以作为预测肝癌患者肝切除术后复发和转移的甲基化生物标志物。在肝癌组织中，谷胱甘肽S-转移酶P1（GSTP1）的甲基化率明显高于结节性异型增生组织和肝硬化组织，表明生存率低。Schaeffeler等人基于组织芯片分析发现肝癌中有机阳离子转运体OCT1（SLC22A1）蛋白表达水平显著下调。SLC22A1表达与增殖标记物MIB1/Ki-67的表达呈显著负相关。这与非肿瘤邻近肝组织相比，肝癌组织中SLC22A1的DNA甲基化显著提高，而组织学正常肝组织中SLC22A1的DNA甲基化最低。SLC22A1的DNA甲基化与肝癌中SLC22A1的下调有关，可能成为肝癌诊断和预后的一个新的生物标志物。此外，通过去甲基化药物靶向SLC22A1甲基化可能为肝癌的抗癌治疗提供一种新策略。

2.肝癌患者血清/血浆和体液中用于诊断的DNA甲基化生物标记物：除了分析肝癌组织中用于诊断和预后的DNA甲基化生物标记物外，我们还查阅了肝癌患者血清/血浆和体液中用于诊断的DNA甲基化生物标记物。在这些样本中，也能检测到DNA甲基化的分子标记物。通过对比分析健康对照组外周血单个核细胞和T细胞中的DNA甲基化，揭示肝细胞癌PBMC和T细胞DNA甲基化的特征，易于区分早期HCC与慢性乙型和丙型肝炎以及健康对照组，且随着HCC的进展而加剧。数据也支持使用这些图谱进行早期检测肝癌的可行性。它与AFP相比，DNA甲基化标记物具有早期临床诊断和高灵敏度的优点。G蛋白偶联胆汁酸受体Gpbar1（TGR5）是一种新发现的肝肿瘤抑制因子，因为TGR5启动子高甲基化在HCC（77/160，48.13%）中的发生率明显高于慢性乙型肝炎（12/88，13.64%；P<0.01）和健康对照组（2/45，4.44%；P<0.01）。血清TGR5启动子甲基化和AFP联合使用具有更高的敏感性、准确性和诊断价值。Felipe等人证明cfDNA中VIM和FBLN1甲基化水平的变化与肝癌相关，并作为血浆检测中有效的生物标记物。此外，深入研究cfDNA甲基化的作用可能为HCC检测和监测高危人群以及治疗方面带来新的启示。此外，建立一种高灵敏度和高可靠性的新的诊断策略来监测危险因素以早期发现HCC是非常必要的。近年来，“液体活组织检查”（包括循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA（ctDNA））已成为表征循环细胞的技术，为患者的个体化治疗提供了坚实的基础。液体活检作为一种无创检测方法，有望在肝癌的早期诊断、动态监测和药物筛选等方面发挥重要作用。利用半导体测序技术分析靶向甲基化水平后发现在对照组和肝细胞癌病例之间可以检测到cfDNA甲基化的差异，可作为早期诊断肝癌的一种方法。

发现高效的DNA甲基化生物标志物对于肝癌的诊断和预后意义重大。然而，大多数肝癌的甲基化生物标志物仅限于实验室研究阶段，其特异性和敏感性尚未得到临床证实。联合检测肝癌的甲基化标志物和非甲基化标志物可在一定程度上可弥补单一检测的缺陷，有助于提高术后复发的诊断率，但却会给患者带来一定的经济负担。因此，迫切需要寻找更多有价值的甲基化生物标志物，作为肝癌发生发展的早期预警。

肝癌的表观遗传学是高度复杂的，虽然大多数表观遗传学研究慢慢确定了肝癌治疗干预的潜在靶点，但大多数研究缺乏深入的验证。肝癌表观遗传学中的DNA甲基化研究有很大潜力成为肝癌诊断和治疗的风向标。因此，未来的研究方向应该更多地集中在针对DNA甲基化特异性抑制剂的开发、发现更加有效的肿瘤转移生物标志物。这无疑能成为将来肝癌研究的新方向之一。