吴宗勇 齐军：胃癌相关生物标志物检测与早期临床诊疗价值
文章刊载于《临床实验室》杂志2023年6月刊“恶性肿瘤实验室检测”专题-「专家论坛」版块 页码p65-p70
【摘要】胃癌是临床高发的恶性肿瘤之一，早期的诊断与治疗是胃癌临床诊疗的关键。肿瘤标志物检测具有操作简单、快捷等优点，是现阶段胃癌辅助诊断中较为常用的方法。随着医学技术的不断发展，对胃癌的研究也不断深入，使得更多胃癌相关生物标志物在临床上被发现。基于此，本文对近年来临床中所发现的部分新型胃癌生物标志物进行总结，以期对早期胃癌的临床筛查及辅助诊断提供参考。
基因相关生物标志物
1.ctDNA：循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是来自于转移肿瘤、原发性肿瘤以及循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTCs）的无细胞DNA。和传统的肿瘤标志物相比较，ctDNA具有重复性高、侵袭性小且取样方便等优点。近期研究表明，ctDNA在胃癌的临床诊断中具有较高的特异性，但与传统肿瘤标志物相比，其敏感性没有差异。此外研究显示，临床上对胃癌患者进行定量的ctDNA检测具有较高的预后价值。在一项研究中显示，术前循环无细胞DNA（circulating free DNA，cfDNA）水平高表达的患者复发率较高，且总生存期（overall survival，OS）明显降低。在手术治疗前较高的并且术后ctDNA的高水平表达是预测患者病情复发的一个重要指标。另有研究表明，ctDNA和EB病毒（EB virus，EBV）阳性胃癌的诊断及预后均密切相关。因此，我们认为ctDNA已经成为一种新型分子标志物，临床中可以通过ctDNA的片段长度以及DNA变异数等进行分析，对早期癌症的诊断及预后恢复计划的制定起到积极作用。但ctDNA在临床检测中敏感度不高是其主要缺点。
2.CTCs：临床研究表明90%的癌症患者死于肿瘤转移。CTCs作为肿瘤转移的“种子”，从肿瘤原发灶或转移灶脱落，保持了完整的细胞形态和基因信息，通过机体的淋巴和血液循环系统播散并定植于其他器官形成肿瘤转移灶。随着对CTCs研究的不断深入、高通量测序技术特别是单细胞测序技术的发展，对CTCs的应用研究已经从计数走向了分子分型和细胞测序时代。大量研究发现CTCs检测可用于多种实体恶性肿瘤的无创诊断，能够反映恶性肿瘤的转移、侵袭、复发，预测肿瘤患者预后，评价肿瘤患者疗效，辅助制定个体化治疗方案，鉴定抗肿瘤药物的临床价值。CTCs检测被誉为液体活检技术的“三驾马车”之一，代表了精准医疗领域最具潜力的发展方向。同时在临床实践中，CTCs也可以作为预测靶向治疗效果的指标，Chen等研究也证实了此推测。与病理检查相比，CTCs具有可重复且无创的特点，可实时监测癌症转移情况，准确反映癌症进展和临床疗效，可作为胃癌诊断和预后评价的潜在生物标志物。3.RNA：其中包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）、微小RNA（microRNAs，miRNA）、环状RNA（circular RNA，circRNA）、Piwi 相互作用 RNA（Piwi-interacting RNAs, piRNAs）等。
（1）lncRNAs：长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）属于核苷酸序列长度＞200的一种非编码RNA，在染色质重塑、剪接调节、转录调控以及转录后的处理等方面均发挥着重要的作用。且lncRNAs和肿瘤的发生、发展以及预后的均关系紧密。人类基因组中现阶段已鉴定出的lncRNA有56000多个，这些lncRNA中有135个在胃癌中出现表达异常。研究显示，胃癌患者循环H19的表达水平显著高于非胃癌者，且对于肿瘤相对较小的患者来说，H19表达水平也呈现出显著的升高趋势。HG Huang等研究发现，在胃癌组织及细胞中，lncRNA LINC00511表达水平呈现出显著性升高，且与肿瘤的生长、转移以及不良的预后有着明显关系，此外在研究中还发现了一个新的信号轴（LINC00511/miR-124-3p/EZH2），它能够促进胃癌患者与胃癌细胞的增殖及侵袭。以上研究均表明lncRNAs可作为诊断胃癌以及评估其预后的一个潜在标志物。
（2）miRNA：微小RNA（microRNAs，miRNA）是由18-24个核苷酸所组成的一种非编码RNA，是调节细胞迁移、分化、增殖以及侵袭的一种重要分子。miRNA的表达水平和肿瘤大小、侵袭以及转移有着密切关联，适用于对早期癌症的检测。研究表明，miRNAs和胃癌细胞转移以及预后密切相关，如miRNA-20a、miRNA-196a、miRNA-196b、miRNA-125A等，均可作为诊断胃癌以及评估预后的潜在标志物。但在临床实践中，需要通过侵入性手术才可获取患者的病灶样本。因此，我们认为miRNAs可以诊断胃癌并评估其预后疗效，但在一定程度上具有侵入性，并不是临床诊断的理想标志物。
（3）circRNA：环状RNA（circular RNA，circRNA）是一种较为特殊的非编码RNA。circRNA分为外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA、反义链circRNA、基因间circRNA和基因内circRNA等种类，具有稳定性、保守性、亚细胞定位、组织和时空特异性、多样性等线性RNA不具有的特点。临床中已发现的circRNAs大部分来自于基因编码区域的外显子，其余则来自于3′-UTR或5′-UTR、基因间区以及反义RNA。近期临床研究发现，circRNAs对于胃癌的诊断、风险评估、预后以及治疗反应等方面均具有积极作用，极可能成为临床治疗胃癌的新靶点。随着医学技术的不断发展，以及医学研究人员对circRNAs与胃癌关系的临床研究不断深入，相信在不久将来会发现更多与胃癌相关的circRNA分子，并研发出更加安全有效的临床治疗方案。
（4）piRNAs：Piwi 相互作用 RNA（Piwi-interacting RNAs, piRNAs）是一类与 P-element induced wimpy testis (Piwi）相互作用、对基因沉默起重要作用（主要与转座因子沉默相关）的小调节 RNAs。研究显示，piRNAs 广泛参与基因调控，piRNAs 的失调是肿瘤进程中的重要因素。因此，开发 piRNAs 作为潜在的癌症生物标志物具有重要意义。相关研究提示，piRNAs 可能调控与胃癌进展相关的关键基因和途径，但具体调控机制仍然不明了。吕梦圆等对 piRNAs 介导的基因调控进程、piRNAs 功能研究的现状及 piRNAs 基因的遗传改变参与胃癌进程展开概述。他们认为在精准医学时代，从遗传和表观遗传机制方面深入理解胃癌病因学以及 piRNAs 作为转化医学研究的潜在生物标记物的作用至关重要。
4.DNA甲基化：DNA 甲基化是最常见的参与基因调控的表观遗传修饰之一。通常 DNA 甲基化修饰的改变包括 DNA 低甲基化（通常发生在基因未甲基化的区域）和 DNA 高甲基化（通常发生在基因启动子区域的 CpG 岛区域）。虽然正常细胞中一些失活基因的启动子区域可见随机的 DNA 高甲基化，但该修饰并不会影响基因的表达；而已有大量研究表明启动子区 CpG 高甲基化与肿瘤细胞中抑癌基因的转录抑制有关 。CpG 岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype， CIMP）是以多个基因的 CpG 岛同时甲基化为特征， 已被认为是胃癌发生发展的重要机制之一。
5.MSI：肿瘤微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）可以通过调节肿瘤抑制基因、错配修复基因（DNA mismatch repair，MMR）以及癌基因的表达水平而对肿瘤发生、发展起到作用。肿瘤抑制基因以及癌基因则能够通过对肿瘤细胞的凋亡、增殖、血管生成以及免疫逃逸进行控制，进而发挥出作用。而MMR基因则修复DNA在复制及重组的过程中发生的碱基错配、缺失或是插入错误而引发的损伤。MMR基因发生微卫星位点不稳定，主要是由DNA聚合酶的滑移等过程引起的，进而导致了靶基因发生突变。临床上MSI主要在靶抑癌基因或肿瘤基因相关的其他编码区域的微卫星定位发生移码突变。而在胃癌患者中，大约有30%的肿瘤显示出MSI，其原因分析多数为表观遗传沉默而引发的MLH1启动子高甲基化所导致。研究显示，在仅进行手术治疗患者中，MSI-L患者的预后明显差于MSI-H患者，但在接受手术及围手术期化疗时，MSI-H患者的预后却相对较差，表明MSI-H患者在围手术期行化疗的过程中无法获益。近年来的一项研究显示，MSI和临床免疫治疗的疗效关系密切，免疫原性以及免疫检查点的配体普遍表达致使MSI亚型更容易受到临床免疫治疗的影响。基于此，对于适合免疫检查点抑制剂治疗的胃癌复发、局部晚期以及远处转移患者，可优先考虑MSI或错配修复缺陷检测。
6.TP53：TP53是一种非常重要的抑癌基因，在诱导细胞凋亡、异常增殖以及DNA受损等过程中起到关键的调节作用。研究显示，TP53第72位编码基因的Pro/Pro的基因多态性可帮助鉴别T1N1M0/T3N0M0/T2N0M0的相对危险人群。此外，TP53第72位基因编码的Pro/Pro基因型与Arg/Arg基因型相比，Pro/Pro基因型与患者应用卡培他滨和紫杉醇联合治疗的疗效显著相关。且多重生存率也显示，与Arg/Arg基因型相比，Pro/Pro基因型的总生存率和无进展生存期均较低，表明TP53编码基因多态性能有效的预测化疗效果，且卡培他滨和紫杉醇联合治疗在晚期胃癌患者的总生存期以及无进展生存期关系密切。基于此，TP53可应用在预测胃癌患者临床疗效及其预后。
酶和蛋白质相关生物标志物
1.E-cadherin：E-钙黏蛋白（E-cadherin）属于钙离子介导的一种膜分子，在胃部上皮细胞分化及黏附的过程中起到一定的作用，属于较为重要的肿瘤保护体系，由16号染色体中CDH1基因编码。其中CDH1属于胃癌中十分重要的抑癌基因，其抑制能够促进肿瘤细胞侵袭、转移以及增殖。E-cadherin水平失调可能与多种原因有关，如：CDH1基因突变、杂合性丢失（loss ofheterozygosity，LOH）、表观遗传或转录沉默等。研究显示，因E-cadherin的缺失导致的Lgr5干细胞减少对胃窦上皮的稳定及生长均造成一定损害。另有研究表明，lncRNA LOC554202通过降低胃癌细胞中E-cadherin和p21的表达水平，来促进细胞的转移和增殖能力。Yang等研究表明，蛋白赖氨酸甲基转移酶1也通过调节E-cadherin的表达水平在胃癌中发挥作用。还有研究表明，幽门螺旋杆菌能够通过激活基质金属蛋白酶抑制E-cadherin的表达，进而诱导胃癌细胞迁移及侵袭。以上研究均表明，E-cadherin的表达异常和临床胃癌患者的病理表现有着密切关联。
2.Her-2：人表皮生长因子受体-2（Her-2）是一种受体酪氨酸激酶，它在细胞的分化、生长以及增殖中起到十分重要的作用。Her-2在胃与食管交界处肿瘤中的表达水平要高于胃远端肿瘤，且Her-2与肠型胃腺癌的关系也较为密切。近年来，针对Her-2的靶向药物在临床治疗中获得了显著的效果。在一项临床试验研究中，曲妥珠单抗与铂类联合化疗相比单纯的化疗，可明显增加Her-2阳性胃癌患者的总生存期。根据此项研究结果，晚期胃癌患者在治疗前建议先检测其Her-2基因的表达。
外泌体 外泌体是一种外囊性细胞小泡，其直径大约为30~100 nm，由含有跨膜蛋白的脂质双分子所组成。在正常生理条件下，外泌体中包含着多种生物分子，如DNA、蛋白质、microRNAs、脂质以及mRNA等物质，可通过对特定物质的转运来介导局部及远端细胞的通讯功能。外泌体可以反映源细胞的特性，由于脂质双分子层的保护，外泌体可以稳定地存在于各种生物液体中，如唾液、血液、尿液、细胞培养物等。外泌体因为具有上述多种特性使其能够作为可靠的肿瘤标志物。研究显示，从胃癌患者胃液中分离外泌体，发现BARHL2基因的甲基化水平表达相对非胃癌对照组在ROC曲线下面积为0.923，胃癌和非胃癌患者诊断的特异性和敏感性分别为100%和90% 。基于此，我们认为胃液外泌体的检测将成为确诊胃癌的关键标志物。但现阶段对于外泌体的研究还相对较少，仍需在临床中做大量研究来证实。有临床实验在血清外泌体中成功检测到蛋白质GKN1，同时胃癌患者的血清GKN1表达水平明显低于健康人群。结果表明，血清中GKN1的表达水平可准确区分慢性萎缩性胃炎与胃癌，可作为临床诊断胃癌的有效标志物。另有研究显示，在胃癌患者的腹腔灌洗液中，外泌体来源的miR-1225-5p及miR-21表达水平明显升高。该研究也提示外泌体极可能作为胃癌患者术后腹膜复发的生物学标志物，为胃癌患者早期腹膜转移提供新的诊断方法。 PD-L1 程序性死亡受体-1（programmed cell death protein 1，PD-1）属于负性共刺激受体中的一种，其主要表达在活化的T细胞中。PD-1主要通过程序性死亡-配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）及配体2（PD-L2）作用在肿瘤患者的微环境。其中PD-L1是通过巨噬细胞来表达，在炎症性的微环境中通过激活的淋巴/内皮细胞以及其他的非恶性细胞所诱导产生。并且，肿瘤细胞及其相关基质细胞均可表达PD-L1，进而对T细胞的激活起到抑制作用，致使肿瘤细胞增殖不受控制。研究显示，表达PD-L1的幽门螺杆菌感染细胞极有可能发生免疫逃逸，导致患者癌前病变发展为胃癌。另有研究显示，PD-L1表达水平与EBV有着一定的关系，研究中发现EBV感染的胃癌患者其PD-L1的表达水平明显高于一般胃癌患者，同时其预后效果更佳。因此，研究推测PD-L1的发生机制可能与EB病毒潜伏膜蛋白1与EBV共同刺激下产生的干扰素-γ有关。故EBV可能成为预测临床抗PD-L1免疫治疗效果的重要标志物。有研究表明，PD-L1与MSI-H的水平过表达与患者预后效果密切相关。 同时，临床中针对PD-1和PD-L1的药物治疗也表现出良好的前景。在近期发表的有关ATTRACTION 02-Ⅲ期临床试验中，将进展期不可切除的胃癌患者使用纳武单抗以及安慰剂组进行对比，其结果显示，联合治疗后，患者总生存期明显高于对照组。据此研究，日本将纳武单抗批准用于治疗不能切除的进展期胃癌或复发性胃癌。另一项研究关于MSI甲基化表达水平在多项肿瘤中作用，其临床效果较为满意。也同样基于此研究，FDA批准了帕博丽珠在MSI-H胃癌上的临床应用。现阶段，该两种药物均已在我国批准上市，CSCO指南在2019年也已明确指出，免疫检查所使用的抑制剂可用于晚期转移性胃癌的治疗中。但是，现阶段PD-1的抑制剂在临床治疗中还有诸多的问题需要去解决，例如在受益群体上还没有达成共识，在现阶段还未确定哪些患者更适合临床免疫治疗。此外，单药使用的临床疗效相对较低，而联合用药的安全性以及胃癌患者预后不良事件的处理尚未达成共识。基于此，免疫疗法对晚期胃癌患者临床应用后期还需进行大量研究。 小结 随着医疗技术的快速发展，临床中对于分子细胞学以及表观遗传学也同样得到快速的发展，临床中对于胃癌的发生以及涉及的信号途径也变得更为清晰，同时也为临床诊断胃癌早期、复发监测以及转移提供了有利的依据。现阶段，临床中新发现的生物标志物例如TP53、MSI以及PD-1；各种血清指标例如ctDNAs、CTCs以及miRNA等的临床应用，均为胃癌的诊断及监测提供了新的思路。
