文章刊载于《临床实验室》杂志2023年7月刊“临床分子诊断”专题-「专家论坛」版块 页码p32-p38
在临床检验中，分子生物学检测有独特的特点，对人员和环境的要求都非常高。主管部门也出台了一系列文件对于分子生物学检测实验室进行管理，如卫办医政发[2010] 194号文件《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》，对于临床分子生物学检测实验室的管理起到了重要的指导作用。中国合格评定国家认可委员会（CNAS）对医学实验室有完整而科学的认可体系，包括：CNAS-CL02《医学实验室质量和能力认可准则》（2022版正在转化中）、CNAS-RL01《实验室认可规则》、CNAS-RL02《能力验证规则》等。在这些认可规则之下，CNAS还发布了CNAS-CL02-A001《医学实验室质量和能力认可准则的应用要求》，它与准则对应，对准则做了更加详细的说明。准则分为15个管理要素和10个技术要素，本文将就技术要素部分要点在临床分子生物学检测管理中的应用作一论述。
1. 专业技术人员素质：在医学实验室管理中，临床检验工作者往往关注的是人、机、料、法、环，这其中人是中心环节。所有体系的运行、实验的操作、质量指标的实现都需要依靠人员，所以技术要素第一要考虑人员。CNAS-CL02-A001《医学实验室质量和能力认可准则的应用要求》5.2.1指出，人员资质要求特殊岗位人员（如抗HIV抗体初筛、产前筛查、新生儿疾病筛查、分子生物学检测等）应取得相关规范要求的上岗证。从事分子生物学检测的人员必须要取得省级以上机构颁发的上岗证。而对于实验室，5.1.3规定，实验室应至少具有2名检验/检查人员，5.1.6要求应每年评估人员的工作能力。对新进员工在最初6个月内应至少进行2次能力评估，保存评估记录。当职责变更或离岗6个月以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对员工进行再培训和再评估，合格后才可继续上岗并记录。上岗前的人员培训应包括体系和专业的培训，也可以包括生物安全培训，考核评估合格后授权，在人员工作过程中监督。结合人员的工作情况在年底有一次年度评估。形成培训、考核、评估、授权、监督、再评估的闭环。2. 实验室检测设施：分子生物学检测实验室对设施的要求比其他实验室更高，应符合ISO15189.5.2.1条款及下列要求：分子诊断实验室工作区域的设置、进入方向及气流控制等应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》及《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》的要求。工作导则中临床基因扩增检验实验室区域设计原则是，实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须完全相互独立，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全分隔状态，不能有空气的直接相通。也有实验室是分5区、分8区，根据使用仪器的功能，区域可适当合并，例如使用荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；使用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并，可实现原始样本管上机，直接出结果。3. 实验室检测环境：临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。其实也是从最清洁的区域到污染逐渐增大的区域。4. 实验室检测仪器校准：分子检测实验室设备、试剂和耗材中，常用的设备有PCR扩增仪、提取仪、离心机。部分实验室采用热裂解，有加热的装置、微型离心机。设备校准和计量学溯源中规定应符合ISO 15189中5.3.1.4条款以及下列要求：应进行外部校准的设备，可参考ISO17511以及相关专业领域国家/行业标准的要求，如WS/T347并符合CNAS-CL01-G002的要求，至少对与测量结果有重要影响的性能进行校准，如加样、检测、温控等。校准不仅是检测系统或者相关机构关注的问题，实验室工作人员也需要关注。比如提取仪如果有加热模块，则需要关注温度控制；机械臂如果有加样，则需要考虑加样准确度，也要考虑走位准确，包括水平位、上下位，如果走位不到位，将会影响检测结果的准确性。如图1所示，PCR仪包括温控模块和信号检测模块。此报告显示在对检测模块做校准时，对四种染料均做校准，四个通道均兼顾到，建议PCR仪校准时所有通道都做。温控模块校准时温度选择58度、72度、94度三个点，兼顾到变性、退火、延伸三个温度点，实验室在校准前需关注设备使用温度的范围，注意覆盖所有温度区间。还有升降速率、孔间温差的校准都需要做，这样的校准报告才是较为完整的PCR仪校准报告。实验室在校准前要向校准人员明确提出要求，校准完成后要关注校准报告是否通过，项目是否齐全，这样才是一个完整的校准过程。
5. 实验室检测仪器设备维护：5.3.1.5是关于设备的维护与维修的要求。设备发生故障后，应首先分析故障原因，如果设备故障可能会影响方法学性能，故障修复后可通过以下方式进行相关的检测、验证：A001中提到只要是方便的验证方式都可以使用。可校准的项目实施校准验证，必要时，实施校准；也可以用质控来检测，质控的阴性、弱阳性都要做；与其他仪器或方法比对；还有留样再测，以前检验过的样品再检验，样本数建议5个样本。如果关键部位更换，建议对性能影响比较大的做性能验证，可能还需要做校准。6. 检验试剂和耗材质量：5.3.2.1是关于试剂和耗材的要求。实验室制定的试剂和耗材的管理程序，应用明确的判断符合性的方法和质量标准。实验室应选用有国家批准文号的试剂，应保留制造商提供的试剂性能参数。不同的试剂和不同批次间的试剂都有性能验证的过程。定性试验验证需要选择阴性或者阳性。如果是定量试验，最好覆盖整个线性范围，使用5个样本做验证。另外，实验室自制质控品是允许的，自制质控物应有制备程序，包括稳定性和均一性的评价方案，以及配制和评价记录。自制质控品最好能使用半年以上。7. 实验室检验程序验证：5.5.1.2是对于检验程序验证的要求。就检验系统来讲，就是校准、设备的维护保养、检测系统的性能验证、室内质控和室间质评、结果报告。检验程序的验证宜参考相关国家/行业标准，如WS/T403、WS/T406、WS/T494等，分子生物学的性能验证专门的指南是《分子诊断检验程序性能验证指南》CNAS-GL039。其中定量的方法参考《临床化学定量检验程序性能验证指南》CNAS-GL037。定量检验程序的分析性能验证内容至少应包括正确度、精密度和可报告范围，分子生物学检测如果使用煮沸法提取核酸性能验证建议增加抗干扰能力验证。定性检验程序的分析性能验证内容至少应包括符合率，适用时，还应包括检出限、灵敏度、特异性等。性能验证指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照试剂盒或检测系统说明书要求，能复现生产厂家所宣称的检测性能。建议按照5W1H考虑性能验证设计：即什么时间做？在哪里做？为什么做？谁来做？做什么？怎么做？特别要强调谁来做的问题，很多实验室都比较忙，常常把性能验证交给厂家工作人员来做。性能验证验证是对整个检测系统验证，检测系统不仅仅是试剂，还包括设备、环境、人等，人机料法环构成整个的检测系统，人在其中起非常重要作用，谁要操作谁来做性能验证。做好性能验证，对检测系统心中有数，能与临床更好地沟通，更好的解读检验结果。（1）精密度评价和结果：如图2是我们实验室乙肝DNA定量检测更新方法时，选择了六个检测系统做性能验证。做重复性精密度和中间精密度时，低浓度选择了60IU/ml，60IU/ml是当时乙肝临床治疗时大夫关注的一个折点，是临床诊疗中一个重要浓度点。所以在做性能验证的精密度评价时，建议选临床意义比较重大的，比如医学决定水平或危急值等受临床关注的点做精密度的验证。精密度验证是要考察方法学精密度到底好不好和临床需求，实验设计一定要考虑到。
（2）准确度的评价：如图3，准确度评价首选使用标准物质来做评价。如果没有标准物质，有些实验室用能力验证的样本来做，也是个好的来源。注意评价标准，国家卫健委临检中心用log≤±0.4作为评价标准。
（3）分子检测定量下限：分子生物学检测系统建议做定量下限（如图4），对下限的检测能力心中有数更有利于了解检测系统性能。图4显示六个检测系统的检测下限验证结果，每个检测系统检测下限不同，分别有20IU、30IU、40IU、50IU和100IU等，根据各自说明书，用标准品稀释到它的定量下限。共做了25次定量下限检测，结果显示不同检测系统的变异系数不同，差距比较大。如果按照5%的变异系数来评价，这几个检测系统的检测下限都不合格。这提示精密度在检测下限时不是特别好。
（4）线性范围验证：线性范围的检测可以用高浓度的样本十倍依次向下稀释，最后做一个相关r值（如图5）。
（5）分子检测抗污染试验：如图6用高浓度的阳性样本和阴性样本间隔做梅花桩试验。试验设计是连续进行两批96份样本提取和检测，每批样本包括48个108IU/ml和48个阴性样本，阴性和阳性在提取时交叉呈梅花桩式排列，阴阳符合率100%。一次性的抗污染试验一般很少发现异常情况，在样本量大连续多日检测情况下，出现污染的风险高。
（6）抗干扰试验验证：抗干扰试验主要评价脂血，溶血和某些药物对检测的干扰。核酸提取采用磁珠法或者柱提法等纯化方法的抗干扰能力很强，如果使用煮沸法提取核酸，或者不提取核酸直接检测，这种检测系统抗干扰能力会受到影响，建议做抗干扰试验。
8. 提取核酸质量的评价：5.6.2是对于质量控制的要求。5.6.2.1指出，分子诊断实验室应对核酸的质量进行评价，并选择合适的内源性对照如“管家”基因或外源性对照如假病毒作为内对照以评价所提取核酸的完整性，并保留核酸质量评价记录及假阴性率监测记录。分子生物学检测除了样本来源要适宜之外，提取出的核酸质量也很重要，实验室要给予关注，核酸质量评价标准参考《分子诊断检验程序性能验证指南》CNAS-GL039。9. 实验室室内质控：5.6.2.2实验室应使用与检验系统响应方式尽可能接近患者样品的质控物。（1）实验室室内质控品：室内质控品可为商品化质控物或自制质控物。定性检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控物；定量检测项目，应至少使用两个浓度水平（正常和异常水平）的质控物。分子诊断试验时，如开展基因突变、基因多态性或基因型检测，质控物应包括临床常见的或者是最具临床价值的突变类型或基因型，每次使用至少两种型别，并在合理的时间段内覆盖其他型别。例如HPV检测，要求覆盖到临床基因型，即使有些基因型获取不易，但是常见的基因型需要覆盖，如国内常见的基因型为16、18、56型等。（2）实验室室内质控程序：5.6.2.3要求，实验室制定质控程序时宜参考相关国家/行业标准，如WS/T641。定量检测项目的质控数据可利用质控图进行统计分析，包括质控结果、质控物名称、浓度、批号和有效期、质控图的中心线和质控界限、分析仪器名称和唯一标识、方法学名称、检验项目名称、试剂和校准物批号、每个数据点的日期和时间、干扰行为的记录、质控人员及审核人员的签字、失控时的分析处理程序和纠正措施等，质控规则应确保试验的稳定性和检验结果的可靠性。定性检测项目的质控数据应包括阴、弱阳性和/或阳性结果是否符合预期。质控是实验室管理中非常重要的一环，要做好质控的记录、总结和失控的分析。失控时应采取的措施有：重测，排除人为误差和偶然误差；新开质控品，重测失控项目。检测试剂是否出错或质量问题；重新校准再测失控项目；仪器维护，重测质控项目；如果以上措施都没有发现异常则可以请仪器或试剂厂家提供技术支持。需要指出的是如果质控品是RNA，随着储存时间延长可能会降解，质控结果可能发生变化，在使用中一定要注意。（3）室内质控失控分析：阳性质控样本测定结果偏低或者阴性。可以根据李金明教授《实时荧光PCR技术》一书中推荐的相关流程来处理，尤其是要注意观察临床样本情况。分子生物学检测与生化、免疫等检验项目不同，生化、免疫检测是质控在控之后再测试样本，而分子生物学检测是样本与质控一起检测。当阳性质控品检测结果为阴性时，可能有两种情况，一种是临床样本全为阴性，这可能由于Taq酶或反转录酶失活造成，需要更换试剂；另一种情况是临床样本中有阳性，这有可能是加样或者扩增孔的问题。当结果偏低时，需要看有无强阳性样本，如果样本中有较强阳性，则可能是提取中个别孔有问题，如果没有强阳性则是系统的问题，要分别采取不同的措施。而阴性质控样本测定为阳性时，意味着出现了污染。实验室特别注意要防止阳性扩增产物的污染，随着实验室做的检测越多风险越大。尤其是扩增刚完成扩增板温度还较高的情况下，取扩增板时要注意，尤其取PCR管的阳性质控孔，千万要避免打开阳性孔，导致污染。在分子生物学检测中扩增板不能高压，只能用消毒液或者封袋装好直接处理，就是为了防止扩增产物的污染。10. 实验室间比对：5.6.3.2对于替代方案做了要求。能力验证/室间质评不可获得的检验（检查）项目，可通过与其他实验室（如已获认可的实验室或其他使用相同检测方法的同级别或高级别实验室）比对的方式确定检验结果的可接受性，并规定了比对实验室的选择原则、比对样品数量（5个）、比对频次（至少一年两次）、判断标准等。判断标准与分子生物学阴阳性一致，定量实验建议按照国家卫健委临床检验中心的规定标准log≤±0.4。图7是一个实验室比对的示例，比对了肺炎支原体/衣原体核酸联合（MP/CP）检测。其中本院的5个样本都是阴性，符合率100%。但是这个比对方案并不合适，原因是没有一个阳性样本。最好的组合是有一到两个弱阳性样本，一个阳性样本和两个阴性样本。
11. 检测结果报告：5.8.3指出，分子诊断实验室报告内容还应包括方法的局限性、检测结果临床意义的简要解读、进一步检测的建议、相关咨询人员姓名及联系方式等。北京市还要求新冠病毒核酸的检测报告单上需要注明方法学的检测限和局限性。12. 危急值预警报告：5.9指出，LIS应有程序能在计算机发出报告前发现危急值结果并发出预警。应通过相关程序及时通知临床（如医师、护士工作站闪屏）并记录（包括患者相关信息、危急值的接收者、接收的日期和时间，以及实验室通知者、通知的日期和时间）。LIS宜有程序能在计算机发出报告前发现不合理或不可能的结果，患者数据修改后，原始数据应能显示。LIS中应能显示患者的历史数据，便于作比对。13. 实验室信息管理：5.10对于实验室信息管理的要求指出，无论如何，信息的一致性、及时性、准确性都是非常重要的。一致性是在仪器上做出来的结果传到LIS上是否一致，LIS发报告到临床的端口结果是否是一致的。及时性是报告发出去后能否及时传到医生的工作站，能否及时地通知到临床。这些都需要临床平时关注和验证。
