感染性疾病分子诊断方法的质量控制
卫生部临床检验中心 张路 王治国
摘要：检验医学现在已建立临床标本中微生物特性和检出的核酸方法。这些方法使临床实验室提供更加快速和准确的结果，并且已经改变了临床微生物学和传染病的实践。本文内容主要包括试验性能特征的建立和评估，抑制剂及干扰物质，控制假阳性反应，结果的报告和解释，质量保证，监管问题及给制造商和临床实验室的建议。
关键词：分子微生物学，核酸扩增，质量保证，报告，验证
一、分子诊断试验性能特征的建立和评估
对于实验室开发的检测，应该确定以下性能特征：分析敏感性、分析特异性（包括干扰物质的影响）、精密度、准确度、试验结果的测量范围及参考区间。
当可能并合适的时候，需要执行验证，与一个已存在的试验或者被接受的金标准相比较。试验的评估也应该包括发表在同行评议期刊上研究的评论。
试验的开发者应该获得性能规范。在临床评估过程中获得临床性能特征数据，这些数据用于建立通过美国食品药品监督局（FDA）批准的试验。在某一试验发布后在常规实验室通常执行类似的设计研究，并且实际上，应该由机构内部试验的开发者来实施。描述试验的临床性能广泛使用的参数是诊断敏感性和特异性、预测值和诊断准确度。
（一） 检出限（分析敏感性）
一项试验的检出限（LoD）是由某一检测系统具有一定的概率检测到靶物质的最低量，并且是评估分析敏感性的首选方法。在很多临床实验室，术语“分析敏感性”和“LoD”交替使用；然而，LoD是首选的，因为它有更精确的定义。
在一个检测系统的确认过程中，LoD必须在使用的临床标本类型中进行测量。将整个有机体加到已知的阴性样品中是测量检出限的一种方法。另一种方法，如在病毒检测方法的情况下，是将感染细胞稀释到非感染细胞中。
检测系统的整个过程应该是从样品制备到扩增子检测。检出限（LoD）也应该确保能正确地识别和检测基因型和表型的变异。
（二）分析特异性
1.交叉反应性
在验证检测系统或者监测交叉反应性中，应该使用与靶生物密切相关的一组生物。另外，在检测中使用选择的生物要代表生物标本的正常菌群，及通常导致类似的疾病综合征的那些生物。应该记录属、种、参考号（例如, ATCC?号）、检测的菌株数量和接种量。
2.假阳性
应该有足够数量的阴性标本（无靶物质）与阳性标本进行交替检测以确定假阳性率。假阳性来自于靶物质或者扩增子的交叉污染，来自于高背景噪音，或其他非特异性信号源。
（三）精密度
对于产生定性结果（阴性或阳性）的检测系统，有关复现性的试验协议在CLSI文件 EP12——定性试验性能评价的使用者协议的最新版本进行描述。当从定量测量信号来解释定性结果时，精密度评价方案从10至20天间质控结果计算标准差（s）和变异系数在最新CLSI文件 EP5——定量测量方法精密度性能评估中进行描述。使用的控制物应该监测完整的分析过程，并以与病人标本相同的方式进行检测。
（四）临界值（cutoff values）
进行临床研究以验证临界值的适用性。从这些研究，一个基本原理应该被建立以确定临界值，包括临界值如何区分阴性和阳性结果的描述。应确定用来建立临界值的统计学方法。受试者工作曲线（ROC）和其他图形表示是确认临界值的适当支持。
在临界值的验证中，明显的假阳性和假阴性结果通常可以通过应用措施来确定非特异性抑制、培养扩增或者其他实验方法来进行解释。临床信息的评审，对治疗的反应，及其他诊断程序的结果可能对于解决假阳性和假阴性结果是必要的。
（五）诊断敏感性
试验的诊断敏感性是指高于特定临界值的试验结果中患病者所占的比例。理想地，假阳性结果不会导致严重的心理创伤或者额外过高的费用。而且，不恰当的治疗会对病人或者医疗花费产生最小的影响。
（六）诊断特异性
试验的诊断特异性是指低于特定临界值的试验结果中不是患者所占的比例。
当疾病严重但不可治，没有疾病会有心理或者公共健康价值时，或如果假阳性结果会导致严重的心理创伤和/不适当的治疗时，应该强调特异性。
（七）预测值
总的阳性试验结果是真正阳性所占比例被称为阳性试验预测值。总的阴性试验结果是真正阴性所占比例被称为阴性试验预测值。当不恰当的治疗具有严重的后果时，应该强调阳性结果预测值。阴性结果预测值通常对排除疾病是有用的。
（八）诊断准确度
以下的方法用于评估检测系统获得正确结果的能力。
? 已知阳性和阴性标本数量应该平衡或具有统计学意义对检测系统产生正确的结果的能力具有信心。
? 在新的检测系统中平行检测在另一检测系统中已检测过程的标本。
? 与一个参考标准标本也可以是前瞻性的评估。
诊断准确度可以多种形式表达，包括敏感性和特异性、似然比、诊断比值比及受试者工作特征曲线（ROC曲线）下的面积。
（九）诊断价值
根据检出微生物的数量，分子方法的检出限可能会比其他方法更低，应该建立这些低检出限的临床意义。此外，应根据疾病的实验室诊断范围内设置试验的描述，包括分子方法和其他更传统的方法之间的异同点。
（十）试验局限性
在开发和临床评价中应该规定试验方法的任何局限性。重要的考虑因素包括适当的标本、采集方法、运输、标本的保存、干扰物质及生物学假阳性和假阴性。
（十一）实施经美国食品药品监督局批准的试验
对于获美国食品药品监督局（FDA）批准的检测系统，实验室必须证明它能获得的规范与厂商为准确度、精密度及结果的测量范围而建立的性能规范相当，以及证明厂商的参考范围是适合于实验室的患者群体。实验室在获得预期结果上的文件推荐使用至少50例阴性的和20例阳性的临床标本。
二、质量保证
在提供诊断检测服务的临床实验室，质量保证包括检验全过程质量的不间断的和全面的监测和评价。这包括规定政策和程序；识别和纠正问题以确保试验结果准确的、可靠的、及时的报告；确保工作人员的充裕和能力。质量保证的原则应用于分子检测系统的开发，重点在开发设计过程的质量和相关控制的使用。最终产品的制造需要对生产过程及最终的产品资格进行过程确认。对于机构内开发的检测，也应该确定和验证检测方案和试剂规格。
（一）实验室的设计和实践
实验室设计对于分子检测开发及临床实验室常规检测是质量保证的关键要素。理想地，对于基于扩增的检测，三个物理上分开的区域应该是试剂制备(清洁区)、样品制备及扩增及产物检测。
1.单向工作流程
对于分子扩增程序，必须维持单向工作流程。即使用封闭的系统，样品的制备应该最低在二级生物安全柜中执行或者维持在相对于其他区域的正压中。
2．实验室内的实践
实验室内的实践在防止污染及确保优质的检测也是要的。以下是降低污染的风险执行扩增方法推荐的预防措施：
? 对于检测设置，在清洁区和处理标本及提取DNA的区域保持独立的设备和用品。
? 对于试剂制备、标本制备及扩增后分析，使用单独的移液器。
? 总是使用阻止气溶胶（滤芯）的移液器吸头以防止移液器被气溶胶污染；绝不要重复使用吸头。
? 在每个步骤之间，如要求更频繁和当进入或者重新进入分开区域时更换手套 。
? 在区域之间活动时更换实验室工作服。
? 每天用10%至20%的漂白剂给表面去污，然后用酒精或清洁的蒸馏水处理，或按设备制造商推荐进行处理。
? 执行暴露表面和设备的检测（至少一月一次，以及当发现并维修故障时）。
? 在整个工作区内控制气流。
? 统一扩增后产物的所有处理及在规定区域使用的材料。
? 在去除盖子之前，快速地使试管旋转以使任何液体从边上下沉。试管的盖子应该小心地移除以防止气溶胶的产生，并转移一完成就盖上盖子。
? 在添加样品之前，将主要混合物和其他非样品成分（矿物油、dNTPs、引物、缓冲液及酶）加入反应试管中。在进行到下一个试管之前，加完样品之后每个试管都应该盖上盖。
? 除非在使用中，不然保持试剂管盖上盖。
? 持续地实施阴性控制以使它们反映操作的累积效应。
（二） 仪器
必须有证据证明对仪器清洁、功能、校准、维护、维修及使用中的所有仪器的服务进行了持续评估。实验室人员应该坚持厂商为仪器维修提供的推荐规范。厂商也可以为校准仪器提供指导。如果多重仪器潜在地用于相同的检测，应执行不同系统可比性研究以确保仪器间的结果是一致的。
（三）分子诊断试验在开发期间的质量保证（QA）
风险分析对于确定检测的最低要求是必要的，其基于它的诊断用途及使用相关的危害。这些最低要求成为方法可接受的规范。这个过程也应该识别可以影响产品质量及结果可靠性的所有因素。为广谱rDNA PCR评估污染危害的已发表的风险评估可能对为完整诊断程序中遇到的风险和危险建模是有用的。
在检测的开发和优化中，每个实验的方案应该清楚地描述研究的参数、研究的基本原理、预先定义的接受标准及当不满足接受标准时的补救措施。使用程序的描述应该尽量详细以使实验可以重复。当采用已发表报告中描述的试验方法时，实验室必须仔细地对预期的和可重复的性能进行确认。
（四）质控品
早期提出的确认标准对于在检测优化中使用的合格质控品，批次的合格及实践执行是重要的。通常，对于开发实验规格、设备校准、试剂稳定性、复现性、回收研究、交叉反应性研究、干扰研究及临床性能评估需要利用稳定控制材料的验证标准。
1．阳性质控品
阳性质控品可能很简单，比如用水（或者合适的缓冲液）进行系列稀释的纯化靶核酸、替代的样品或已知含有靶核核酸的病人标本。
在检测开发中及可能在方法执行之后纳入常规的质量控制时需要下列类型的阳性质控品：
? 低阳性质控品——低浓度的生物或靶核酸其浓度接近于试验的预期检出限或需要的临床相关的检测水平。对于多重系统，必须包括多个低阳性质控品以避免竞争抑制。对于证明新试剂合格、评估稳定性及检测参量的影响这些质控品应该是或者接近预计的检出限(LoD)。
? 与临床感染过程有关的已知含有靶生物及其变体的病人标本或者实验室样品（基因型和表现型）。
? 替代阳性质控品通过将不同水平的靶生物或靶核酸与靶生物或核酸是阴性的标本进行调配后产生的。注意：当可行时，应使用无毒菌株（例如结核杆菌H37Ra）。
2．空白质控品
空白质控品包括不含样品或不加核酸的水、缓冲液或者其他液体（例如，标本运输介质）。这些物质用来排除试剂污染或增加背景信号。
3．阴性质控品
阴性质控品应该包含已知非靶核酸，而不只是水或缓冲液。包括以下类型的材料：
? 包含已知非靶生物的病人标本或者实验室样品，特别是与相似临床综合症状相关的物质。
? 来自于未感染个体的病人标本或已知不含靶生物的标本材料。
? 质控品包含特定的带菌生物或其他非靶序列，其可能被纳入到来自于基因组或者质粒载体物种的探针中。
（五）制备核酸质控品
用于分离来自于培养基DNA和RNA的方法的标准化对于优化和确认过程，及提供质控品合适与检测来说是必不可少的。应该确定所分离DNA的浓度，并且运行凝胶或电泳图可视化完整性。可以作适当的稀释并以wt/vol表示，并且与原始生物浓度相关。
对于质控品的储存，应考虑以下内容：
? 水是简单易用的稀释剂，并且对于纯化DNA的多种用途更加具有兼容性；然而，在一些下游分析，它可能不会产生最佳的可重复性和效率，并且也可能是一种意想不到的核酸酶来源。
? 稀释的核酸是不稳定的；为了随后的稀释，最好准备几个主要试管可以从存储中拿出。
? 在储存期间为了确保DNA的降解最小化，需使用紧紧加盖的疏水塑料试管（有塑料垫圈更好）。Tris-EDTA缓冲液在室温和冷藏下可以提高稳定性。然而，DNA酶的存在会降低稳定性。如果制剂的纯度有问题，那么储存在-20°C及以下可能会提高稳定性。
? 聚乙烯试管与DNA强有力的结合及聚丙烯试管与DNA的吸附相关，特别是在高离子强度下。
? RNA很容易被RNA酶降解。最适宜储存是在-70°C，在乙醇中更好。塑料试管应该是无菌的、疏水的并且处理时要戴手套。
? 应该避免反复冻融；应该使用无霜冷藏库。
（六）检测开发中的试验类型
在一种方法的开发中，实验性试验和验证试验应该分开，但可以使用相同的设计原则。原则和最终检测系统的复杂性不同，对于设计验证（确保输出满足输入需求）和建立试剂组分规范很关键的问题也会不同（除外与特定微生物特征相关的变量）。整个系统的验证（包含所有的组成检验系统部分）在功能性能规范建立之前对于开发商至关重要，并且对于实验室使用厂商规范，采纳商品化系统至关重要。
1．分析规范
应该使用合适的分析试验（例如，纯度、分子量、质粒片段消化）开发或者建立每个组分试剂的分析规范。这些分析规范可以在机构内部验证或者以来自供应商的分析证书的形式进行确认。如果供应商改变了，或者用于规范确定的分析方法改变了，已制备试剂的性能规范应该重新建立。
（1）寡聚核苷酸引物和探针
当购买寡聚核苷酸，分析证书应该描述序列（包括任何连接物分子的鉴定和定位）、没有连接物的寡聚核苷酸的分子量、用合适方法进行的纯化和碱基组成。对于实验室建立的规范，应该检查每一批的分析证书，包括稳定性和储存条件。
在试验系统试剂使用之前，合成或购买的寡聚核苷酸的每个新位点应该符合已建立的物理规格（例如，浓度、纯度及碱基组成）。
a 纯化
制造商常使用高效液相色谱法（HPLC）用于评估寡聚核苷酸的纯度。
b 附属物
当探针被附加在固相组分上作为整个检测系统的一部分，额外的检查需要以确保一致的和适当地附属物在最终的构型中是稳定的。
c 浓度
可以使用几种方法来验证和调整浓度。方法的选择取决于被检测到的寡聚核苷酸的浓度及所需的精密度。方法包括分光光度法、琼脂糖凝胶和荧光方法。
（2）酶
应该按照规范和已建立方法化学过程来选择聚合酶、其他核酸修正酶、激酶、内切酶及污染失活酶。供应商应该为最小活性特征及检验这些特征的环境提供规范。应该规定其他相关的物理性质（比如，PH、纯度）。
2．功能性能试验
在试验系统开发之后，为了验证最优化，应该使用真正的病人控制标本，或者用于估计临床样品中基质及真正的生物水平的不同浓度的质控品。应该在检查整个系统之前对扩增和检测系统进行功能上的独立的检查。一旦扩增或者检测步骤被优化，应该用临床标本对整个系统进行功能上的验证及再次改进，这对优化性能是必须的。功能试验协议必须预期地设置检测性能标准，这能保证在合格基质的极端条件下及受试样品条件下回收或检测核酸。空白限及检出限的功能规范应该及早开发以检查试剂及项目检测临界值。
（1）检出限（LoD）
监测真正的检出限允许开发商功能性地评估改变，提取程序的适宜性，及其他参数的影响。任何检测的检出限在实验室间可能是不同的，这取决于含有靶物质的控制样品的本质及试验条件。由于这个原因，被描述特征的低阳性质控品必须在开发过程中及早确定。
? 评估检出限需要首先确定检测临界值（背景信号和一个真实的信号之间的区别要点）使用空白及基本上的预期样品类型以确定背景水平（噪音水平）。
? 首先，几个浓度应该运行以评估最接近检出限的那些浓度（或应用probit分析）
? 一个附加步骤是用多重复制品来运行已被评估的检出限以确保统计可信度。
? 记录试验浓度，通过被取样的制备品的稀释wt/vol（比如，1 ng/mL）及用于检测的最终体积。
注意：对于临床诊断检测，有关的检出限应该与提取或分离自预设体积的临床标本的DNA的量相关（而不是每个检测能检测到的量）。
? 这个实验使用的DNA应该使用与最终检测样品制备中使用的同样的方法提取/分离，因为不同的方法将会有不同的修剪和基因巧合效果。
（2）污染核酸序列及其他潜在的干扰效应的检测
试验系统中使用的组分试剂或者其他材料的新批号应该避免污染核酸序列及可以带来提高的背景信号的其它物质的污染。
为了背景信号，应该扩增或试验大量的阴性空白样品（扩增试剂中的水或缓冲液）。对每一循环应使用至少有20-30次重复。不应该存在阳性结果，并且阴性背景信号（或者其他检测反应）不应该增加或与预测的不同。对检测系统一旦建立可接受的背景信号，对于合格的新试剂应该规定可接受的信号反应水平（及重复数）（比如，使用20个重复，没有结果大于2到3SD既定的范围）。
（3）评估试剂组分的抑制性
在过程中应该及早确定加入材料中的低浓度核酸，并且作为预期系统输出测量的参考样品使用，贯穿整个开发过程。这个材料和其他的一起，对于功能检查及赋予新试剂合格有用。应该建立可接受的反应范围并且理想地应该用一个已知抑制物的低水平来验证故意污染。
（4）其他类型的功能检查
包括扩增效率、连接物效率/一致性、杂交、污染控制效率、仪器和系统携带污染、限制模式及整个试验系统的功能比较。
3．样品制备方法（细胞裂解和提取）的资格
对分子诊断试验开发一种样品制备方法的主要关注的问题是从靶生物（细胞裂解）中释放和稳定核酸和以最高效的方式并不在过程中产生抑制物和污染的情况下分离（并浓缩，如果使用的话）靶核酸。理想的方法应该是简单的、高效的、可重复的、并产出高分子量的核酸。如果病毒或者其他专性胞内寄生生物是靶病原体，样品制备的方法应该可以裂解病原体寄生的宿主细胞，除了裂解细菌细胞壁，蛋白衣壳等。物理和化学两种裂解方法都可能被直接试验的临床标本和培养材料所需要。这取决于生物的特征。任何开发的程序或者任何商品化的提取系统应该评估回收效率和干扰效应 。
以下是微生物核酸试验样品的明确相关注意事项：
? 当靶子生物通常以高浓度存在时并且抑制物水平最低时，粗溶菌产物可直接用于扩增检测。
? 序列捕获程序被越来越多的用于在裂解后从标本抑制物中分离靶物质。商品化的提取试剂盒可广泛得到，并且常常适用于多种标本类型。带有裂解/提取协议的商品化基于扩增的检测也可被利用。这些中的一些可能过度简化了样品制备和DNA提取步骤。用于商品化中的缓冲液和方法可能不允许不同类型临床标本中某些生物的完整细胞裂解。
?对于干扰影响，已开发的检测系统应该检查用于样品制备的所有材料（缓冲液、添加剂、化学试剂），包括商品化提取试剂盒 。为了保证额外的标本可利用于重复试验，在核酸提取或者其他苛刻的处理之前，如果可能的话，标本可以分割。一旦提取，在进一步处理之前核酸样品也可以进行分割。
4．标本类型
合适的标本类型通常是从临床研究和临床实验使用其他试验方法（培养、免疫组织化学法、显微镜检查法或病理结果）推测出来的。对于新描述的感染性疾病，可能需要额外的研究来确定适于在临床标本中直接检测一种特定病原体标本类型。标本类型应该是容易获得并能运输。当一个个体被感染或者有症状（或者没有症状，而是当试验方法被用于筛查时）时，靶病原体应该是存在的；靶核酸可靠分离所需的标本材料的体积应该是对于常规临床试验实用的。对于用于鉴定标本中培养分离的生物的方法，这个方法设计要素应该最小化。
? 标本中抑制物的存在（或可能存在）可以从试验系统中之前的实验或其他试验系统中其他人使用一种特定的标本类型得到的报告中得知。内源性或外源性成分的抑制的可能性应该在样品制备方法开发阶段使用受试群体中的典型标本类型来进行探究。
? 容器和收集设备应该不包含可能会在试验系统中引起干扰的核酸酶和可溶性成分。如果普通的目的类型采集材料不能干扰任何的试验系统，那么应该规定开发期间使用的特定材料。
? 一些标本类型可能不是均匀的。它们可能需要额外的处理以保证最优的取样。对于整个试验系统中的干扰效应，应该评估应用于标本处理的所有程序。在很多情况下，对于可靠的临床检测可能需要采集多个标本 。
（七）分子诊断试验的质量保证
对于一个执行诊断分子试验的实验室，质量保证包括分析前，分析中和分析后的过程。一些已被应用的实践将会依赖于检测是机构内开发还是用商业性试剂盒执行，以及是否执行多种检测。不管使用的检测或试剂的来源，所有临床实验室必须采取实践和程序以使带来假阳性结果的污染风险最小化，以及控制抑制带来的假阴性结果。
美国医疗保险及医疗补助服务中心[42 CFR§493.1256(d)(3)(iii)]要求至少每天一次对病人标本进行检测和检查，执行以下：
(1) 对于每个定量程序，包括两个不同浓度的控制物质。
(2) 对于每个定性程序，包括一个阴性和阳性质控品。
(3) 对于产生分等级结果的试验程序，包括一个阴性质控品和分等级活性的一个质控品。
(4) 对于一个提取阶段的每个检测系统，包括两种质控品，其中一种是能够检测提取过程中出现的错误。
(5) 对于每个分子扩增程序，包括两种质控品，并且如果反应抑制是假阴性结果的一个重大来源，一个质控品应该能够检测抑制。
对于监控整个分析过程的有内部和/或程序上的质控品的试验系统，将来使用外部质控品可能更不可信，特别是充分控制试剂完整性及样品处理充分性的封闭性系统，及合并内部质控品以监控样品干扰和/或抑制的封闭系统。
三、控制假阳性核酸靶片断扩增反应
核酸扩增方法临床应用面临的重大挑战是污染核酸带来的假阴性结果的出现。扩增技术从少量靶生物中生产一个序列的大量拷贝的能力必须要求特别小心以避免DNA和样品之间转换带来的假阳性结果。临床实验室中的核酸污染有四个主要来源：
? 来自含有生物的标本的气溶胶或者飞溅的污点（交叉污染）；
? 标本或者含有靶物质的扩增试剂来自阳性质控品或者通过空气传播的生物的污染（比如真菌孢子）；
? 扩增产物的积聚，可能影响试剂、缓冲液、实验室玻璃器皿、设备（特别是自动移液器）及通风系统；
? 来自检测系统的非特异信号。
假阳性的危险可以通过小心翼翼的实验室实践，工作区域的严格区分及工作环境的常规去污染来降低。一旦污染出现，即使更换所有的自动移液器和试剂，所有的表面都被清洁并去污染，污染也很难以消除。
如果怀疑污染或污染成为一个问题，应采用工作区域的分开及严格注意推荐实践。鉴于与宽范围rDNA PCR有关的独特挑战，即使是密闭系统要求仔细地管理工作环境和试剂。
（一）试剂和溶剂
核酸扩增中使用的所有试剂必须进行制备，分成等份，并被储存在与标本制备或者扩增后区分开的区域。购买的试剂和溶液应该是分子等级。
应该使用专用的设备和用品。主要基质（不管是从商品形式获得的还是机构内制备的）可以按每个反应批需要按体积等份分装。这可以使取样量最小化并降低危险的可能。应该记录所有的试剂份批号以便如果污染出现，就可追踪来源。
（二）实验室实践
建立一个从“清洁”到“污染”的同向工作流程可减少扩增子携带污染的可能。颜色编码的设备、试剂及供应品可帮助确保维持一个同向工作流程。二级生物安全柜应该用于标本保护。在标本处理之前，应该保留等份标本可用于重新检测或受委托用于额外的检测。
（三）质控品的选择和制备
1．阳性质控品
阳性质控品是含有低浓度的靶核酸并且微弱地扩增。使用低阳性质控品可以使设置和处理期间靶物质污染标本的危险降到最低。
2．试剂空白（非模板质控品）
可应用的试剂质控品应该分布在每个扩增批运行中。这些质控品包含反应必需的所有组分，而没有添加模板核酸。这些最好应该在整个程序中与标本并行运行（以提取开始）。
3．阴性质控品
阴性质控品应该包含已知的非靶核酸，而不只是水和缓冲液。总是分配和转移试剂到持续的阴性质控品中以便它们反映操作期间的累积效应。
（四）扩增产物失活方法
在一个典型的PCR反应中，总共有1012个一致的扩增子被生产出来。一般地，特定的失活方法应该在开发期间被并入每个检测中，因为失活的成功取决于扩增子长度及G+C含量，以及被扩增的靶物质的量。无论是酶还是光化学失活方法都不能防止标本中或者其他外源性的靶DNA带来的反应的污染。多重限制酶和内切酶（比如DNA酶）也可能对选择性失活扩增后产物及处理试剂有用。密闭管子中的完整反应在处理之前可以用漂白剂处理。
1．酶失活
因为自然出现的靶DNA不含大量的尿嘧啶残基，所以这个方法只允许来自临床标本中生物的DNA的扩增。
（1）使用UNG—引物的扩增反应的优化
对于使用UNG的扩增反应的优化，引物应该被选择以便扩增产物足够大以被高效的失活（100-500bp被推荐）。一些调查者发现在UNG协议并入以后敏感性降低了。
（2）dUTP的浓度
允许有效率扩增的最佳的dUTP浓度必须依据经验确定。这可能取决于含量及靶序列的长度。
（3）融链温度
反应在分析之前应该保持在72°C以防止扩增后降解及信号的减少。另外，引物和协议应该设计以使高于55°C的引物退火温度应用于热循环配置文件。
（4）探针杂交
dUTP替代可以降低用于确定特定PCR产物的存在的寡聚核苷酸探针之间的亲和力。通常，通过减少探针杂交或洗脱的严格性可以克服亲和性的降低。
2．PCR后光化学失活
这个方法已经被报道有假阴性结果，特别是对于低含量的靶序列的检测。
跟酶UNG方法不同，除了反应中的扩增产物，原靶DNA也被失活。降低了被处理反应中靶物质积聚及其他序列后续扩增的危险，这个处理结果出现在反应中。
3．局部失活方法
局部失活方法可被用于清除反应混合物的溢出及作为常规质量控制（QC）程序的一部分来清理表面和设备。
? 一个有用和有效的方法是次氯酸钠（日常漂白剂）的10%(v/v)稀释。漂白剂溶液的稳定性受温度和储存容器类型影响（黑色密闭容器是最好的）。有机物质的存在会降低效力。
? 放于工作表面上方的紫外灯也可以有效地控制小量（100pg以下）核酸的污。为了消除200个碱基对或者更大的扩增产物，过夜的辐射照射是必须的。紫外光照射和高压蒸气处理不能消除PCR污染并且不应该作为主要的污染控制方法。
4．扩增产物失活方法的确认
一旦扩增反应被灭活协议原位优化，应该做出污染控制措施的一个效力评估，方法是：故意地用改进产物的稀释液污染反应混合物，然后和未处理的质控品的结果进行对比。
然后，如果一个实验室决定将一个灭活方法转换成另一个，像之前陈述的，它应该在执行改变之前验证新方法。
四、结果的报告
多种实验室内开发和商业的获得的实验用于分子微生物学。同一个生物的试验在扩增方法、核酸靶片断及性能特征上可能不同。为了避免混淆，实验室可以在最后的报告中包含使用方法、核酸靶片断、参考范围及这个实验的很多限制因素的描述。对于使用分析特异性试剂的实验室内开发的方法，应要求额外的清楚的声明。
（一）生物和靶核酸
分子方法的结果不应该被报告为简单的“阳性”、“阴性”或者“可疑”。在最小值，结果应该指出此生物和靶核酸（例如“检出HIV-1DNA”，“检出沙眼衣原体质粒DNA”，或者“检出的HCV RNA”）。实验室应该在报告中更加明确地定义靶核酸，如果该信息在试验结果解释中是重要的。
（二）可疑结果
如果一个试验有一个在临界值周围已制定可疑范围，那么在那个范围内的结果可以报告为“可疑的”或“不确定的”。实验室也可以遵循用同样或者不同方法进行重新试验的算法或者要求用另一个标本。在假阳性结果可能对病人有重大影响的案例中（比如HIV的阳性结果），应该考虑重新试验原来的标本和/或实验附加新鲜标本。
（三）参考范围
一个试验的参考范围应该包含在报告中。定性试验的参考范围应该描述为低于较低检出限，或未检出。例如一个检出限为50IU/mL的HCV RNA试验的参考范围会是“<50IU/mL，”或者“未检出”。
（四）危急结果
对于试验必须规定危急结果，其显著影响病人的管理决策，并且按照程序必须迅速地通知医生或者其他医疗提供者。执行试验的人员必须对他执行的危急结果程序熟悉。
（五）试验的局限性
在报告中应阐明试验的任何已知的临床上显著的局限性。这些可能包括交叉反应、基因型偏倚及干扰物质的存在。对于FDA批准的试验，这些限制因素在说明书中已给出。对于实验室内开发的试验，在程序手册中应规定这些内容。当替代标本类型或者预期用途的性能特征还未建立时，在报告中应该包括一份适当的免责声明。
（六）解释及澄清申明
1．一些试验的报告需要解释性的注解。对于这些试验，实验室必须有一个程序确保报告在发布之前由有资格的人员已审核和批准该报告。
2．分析物特定试剂 (ASRs)
对于使用ASRs的试验，实验室在报告中必须包括FDA要求的免责申明。FDA把ASRs定义为试剂，其通过与临床标本中的物质特定地结合或发生化学反应，是用于生物标本中的配体或特定化学物质的识别和定量的诊断应用。此免责声明强制性语言是“这项试验的开发及其性能特征的确定是由XXX（加上该实验室的名称）完成。它还未获得美国FDA的放行或批准”。
现行的ASR免责声明要求不适用于所有的实验室内开发的试验或FDA批准未标志用途的试验，而只适用于从贴上ASRs标签厂商购买的产品。
3．选择性的使用
如果这个试验用于除了它预期用途以外的目的，试验报告必需带有一个免责声明。这应该应用于获FDA批准的或者实验室内开发的试验。这个免责声明应该表明这个试验对于这个用途还未得到验证，且结果应谨慎解释。
五、对制造商和临床实验室的建议
（一）监管要求
只要可能，设计的检测应该满足适当的监管和认可的要求。特定的要求将依赖于试验和分析物的类型，及执行这个试验的实验室的权限。商品化产品的FDA要求是广泛的，这些要求的描述超过了本文的范围。对于不同国家的监管要求，联系适当的监管机构或已公布的指南。
（二）对检测开发者的建议
新的核酸检测系统的开发应该包括设计控制要素。检测厂商有职责确保所有的配件设备和组件为整个检测系统的预期用途而得到充分的确认，并确保配件设备和组件在一个质量系统中进行设计和开发。所有系统兼容性问题都使用一个标准的风险分析方法。在开发期间，检测系统应该定期地重新评估以确定原始的设计要求得到满足。
以下信息应该包含在每个商品化试验试剂盒和/或体外诊断用途的实验室手册中：试验的预期用途、有关警告和限制的标记、储存说明及标本采集和运输。
（三）对临床实验室的建议
当两种试验方法的性能特征比如准确度、精密度、分析的敏感性和特异性具有可比性时，应该考虑其他的特征比如结果的周转时间、完成检测所需要人员的时间、试剂和仪器的成本等。
基于制造商的说明书、文献的审核及实验室人员自己对试验的验证，由实验室人员书写试验程序文件，应关注和记录与试验开发者程序的偏离，及重新验证程序。实验室负责人应该鼓励并促进医生和实验室关于试验的适当使用及结果的解释进行交流。
医生应该知道干扰试验性能的物质和条件，以及标本稳定的重要性。
参考文献
[1] CLSI. MM3-A2—Molecular Diagnostic Methods for Infectious Diseases; Approved Guideline—Second Edition (2006)..
[2] 王治国主编.临床检验方法确认与性能验证.北京：人民卫生出版社，2009年12月.
[3] 王治国编著.临床检验质量控制技术.北京：人民卫生出版社，2008年8月.
摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第十期
编辑：范伟伟
