质谱仪在临床实验室中的应用简介

       苏增留，华西医科大学检验医学学士，卫生部临床检验中心临床化学硕士，2008年获得美国爱荷华州立大学（Iowa State University）生物化学博士。2009年至2011年在范德堡大学（Vanderbilt University）从事肿瘤个性化医疗的研究，其所建立的基因检测方法被范得堡大学附属医院临床分子生物学实验室所采用。2011 年至2013年在南卡罗来纳医学院（Medical University of South Carolina）病理科进行临床化学专业训练，并顺利通过美国临床化学认证委员会（American Board of Clinical Chemistry）的临床实验室主任（Laboratory Director）资格认证。现在美国Ameritox担任实验室主任，并拥有美国多州的临床实验室主任执照。主要从事药物检测和基因诊断的临床工作，在“Science”、“Nature Communications”等知名杂志发表论文及综述20多篇。

       质谱仪的历史可追溯到1897年，诺贝尔奖获得者Sir Joseph John在一次演讲中第一次提出了质谱仪的概念。随后的应用主要是局限于物理和化学领域。随着离子化技术的突破，质谱仪在近10年来开始进入临床实验室。因为具有较高的灵敏度、特异度和准确度，其在新生儿遗传疾病的筛查，药物监测（包括治疗用药物和违禁药物），激素水平检测方面有着其它传统方法不可替代的优势。并且从长期来看，质谱仪的检测成本低于大部分目前临床实验室中的检测方法如免疫法（虽然目前质谱仪仪器比较贵，但其后的应用基本不用购买试剂）。随着自动化程度的不断提高，笔者相信在不远的将来，质谱仪在临床实验室中将会有更为广泛的应用。

什么是质谱仪？

       简单的说，质谱仪就是通过测定离子的质量（mass）和电荷（charge）比（m/z）来定性（qualification）和定量（quantification）被检测物质（analyte）。需要指出的是，质谱仪只能检测气相离子（gas - phaseion）。也就是说，所有的分子在进入质谱分析器（analyzer）之前必须经过离子化（ionization）。在实际应用中，离子化装置（ionization device）和质谱分析器（analyzer）是整合在一起的。
       在临床实验室中通常用两种离子化方法：电喷射离子化（electrospray ionization）和大气压化学电离法（Atmosphere Pressure Chemical Ionization：APCI）。形成的离子束进入分析器（analyzer），通过调节电压等参数，可以让只带特定质/荷（m/z）比的离子通过，从而达到定性和定量目标分子的目的。
       分析器（analyzer ）是质谱仪的核心部分。质谱仪的分类和命名正是基于分析器的类型。市场上有基于各种原理的分析器，但临床实验室中常见的有三种：

       1）四极质谱分析器（quadrupole analyzer）。这是最常用的一种分析器。由四个平行的圆柱形电极棒构成，其中两个带正电，另外两个带负电。在特定的射频和电流下，只有带特殊“质/荷”比（m/z）的离子才能通过最终达到检测仪（detector）。为了提高其特异性，临床实际应用中通常把两个（或以上）四极质谱分析器偶联在一起。这就是大家经常看到的“tandem mass（MS/MS）”的由来。在小概率的情况下，有可能两个结构及其相似的分子产生相同质/荷比的离子，为了把它们区分开来，再偶联上一个分析器，并在这两个分析器之间加入一个碰撞室（collision cell）（图1）。第一个分析器筛选出来的离子称为“parent ion”。如果有两种结构相似的分子产生了相同的parention，第一个分析器并不能把它们区分开来。这些离子将一起进入碰撞室，在特定能量的撞击下，产生出“daughterion”。不同分子即使有相同的“parention”，但产生相同daughterion的几率微乎其微。通过调射频或电流等参数，只有特定的daughterion才能通过第二个分析器并最终被测定仪（detector）记录到。

       2）飞行时间分析器（Time of Flight analyzer：TOF）。顾名思义，这种方法是通过记录被检测离子从进入分析器到到达终点（detector）所需要的时间来定性或定量分子的。TOF主要由一个长长的“管道”构成，不同的质/荷比的离子穿过这个管道的时间不同。读者可以用蛋白质的电泳来类比。这种分析器有很高的分辨率。为了加强分辨率，市场上有四极质谱与飞行时间分析器质谱连用的质谱分析仪（Quadrupole-Time of Flight：Q-TOF）。就是图1中的第二个分析器由四极质谱换成TOF。随着固相分离技术的发展，笔者认为Q-TOF连用的质谱仪将会在临床实验室中有越来越广泛的应用。
       3）离子陷阱分析器（Ion Trap Analyzer ：IT)。IT可以把离子“困”在一个3维的空间里，通过调整参数，只有带特定质/荷比的离子才能被“弹射”到测定仪被检测到。这种分析器在临床实验室不多见。
       不同于研究型实验室，临床实验室往往是用于测定已知物质，也就是说我们已经知道我们要检测的是什么，用于建立方法的各种参数应该比较容易确定。很多质谱仪的生产厂商都能提供一些主要检测物的操作规程，一个成熟的生产厂商还会协助用户建立一些检测方法。对临床实验室来说，方法的建立应该不是困难的事情，主要是缺乏有经验的质谱仪操作人员。

为什么质谱仪总是和气相（GC-MS）或者液相层析（LC-MS）分不开？

      大家听得最多的就是“液相质谱”（LCMS）或者“气相质谱”（GC-MS），很少说到单独的质谱仪。这是因为大部分的检测样本，尤其临床实验室中常见的血液或者体液，含有除目标物质以外的很多杂质，这些杂质会对质谱仪造成损害，并且干扰检测。因此在进入质谱仪之前，基本都有一个样本的初步纯化和分离过程，应用最广泛的样本分离和纯化方法就是高效液相色谱（HPLC）或者气相色谱（GC）。只有能够气化（volatile）或者处理后能够气化的物质才能用气相色谱，因此限制了其在临床实验室中的应用。高效液相色谱和双质谱连用（HPLC-MS/MS）是临床实验室中最常见的配置。值得一提的是，因为具有很高的分离效率，毛细管电泳和质谱联用也是当前一个比较热门的话题。
       相对复杂的样品处理过程阻碍了质谱仪自动化程度的提高，从而限制了其在临床实验室的广泛应用。一项新的技术的应用可能会改变这样的状况。目前，一家公司推出了一种和质谱联用的固相分离技术(Rapid Fire)，病人样本可以简单的稀释后直接上样(dilute and shoot)。大大的简化了操作过程，增加了自动化程度。并且一个样本的分析时间可以从几分钟急剧减少到数十秒钟，同时因为新型的固相分离柱（cartridge）的成本低于传统的色谱柱（column），检测成本也大大降低。然而，这种固相分离柱只是简单的去除了影响质谱分析的杂质，并没有像色谱那样起到初步分离的作用。因此，整个系统的分辨率降低。为了克服这一弱点，可以考虑双质谱联用时，第二个质谱仪采用TOF而非常见的四极质谱，如前面所述，TOF有很高的分辨率。实际上已经有这样的质谱仪（Q—TOF）应用于临床实验室。
       值得一提的是，我们在这里虽然讨论了很多“联用”，但在实际中，这些仪器都是整合在一起的，你所见到的很可能就是“一台”仪器。
       质谱仪首先被广大检验人员认识是因为他在参考方法中的应用。随着操作步骤的简化及自动化程度的提高，质谱仪已经丢掉了高高在上的、被贵族化了的姿态，开始走进常规的临床实验室。随着技术的突飞猛进，基于质谱分析、囊括大部分传统生化以及免疫检测项目的全自动分析仪并不是一个遥远的梦。

                                 摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第十一期
                                                            编辑：范伟伟