质谱在免疫学中的应用及研究进展

      质谱(mass spectrometer , MS) 分析是分析化学中进行物质成分和结构分析的主要技术之一,其基本原理是将分析样品在特定的条件下转变为高速运动的离子,这些离子根据质量、电荷比的不同在静电场和磁场的作用下得到分离,然后用特定的检测器记录各种离子的相对强度并形成质谱图。质谱仪的核心是离子源和分析器。目前分析器的类型主要有四极杆(quadrupole) 、离子阱(ion- trap) 、飞行时间(time of flight , TOF) 、离子回旋共振(ion convolution resonance ,ICR) 等。离子源也多种多样,有工作在真空状态下的如电子轰击源(electron bombardment , EB) ,工作在大气压下的如电感耦合等离子体源(inductively coupled plasma , ICP) ,工作在低压下的如辉光放电离子源(glow discharge , GD) 等,尤其是在80 年代中期,基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption/ionization ,MALDI)和电喷雾电离(electrospray ionization ,ESI)两种新电离技术的发展大大提高了检测的灵敏度和相对分子质量( Mr ) 范围, 使得在fmol(10^-15 ) 乃至amol (10^-18 ) 水平检测Mr 高达n ×10⁵ 的生物大分子成为可能,开拓了质谱学一个崭新的领域———生物质谱,促使质谱技术在生命科学领域获得了广泛的应用和发展。不同的分析器和离子源间可进行多种组合,构成不同性能的质谱仪如ESI-ion trap MS ,MALDI-TOF MS 等,两种不同类型的质谱串接在一起可以形成二维质谱,如三级四极杆质谱与飞行时间质谱的串接(Q-TOF MS) 。我们也可以先用一级质量选择器将母离子或者标记离子(presursor or parent ion) 先过滤出来,然后用碰撞诱导分解(collision induced dissociation , CID) 技术将离子打成碎片,产物碎片离子用另外一级质谱分析器分析,从而利用串级质谱(tandem mass spectrometry , MSⁿ ) 对待测物进行精细结构分析如肽段的氨基酸序列分析。另外,为降低被分析样品的复杂程度,我们可以将具有很好分离能力的毛细管高效液相色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱与质谱联用,从而能充分利用二者的优点,既提高分离效率简化分析体系,又能保证分析的准确性,大大扩展了质谱的应用范围包括环境化学、医药卫生、食品等。
      免疫学是研究机体免疫系统结构与功能的学科。一个完整的免疫应答过程包括抗原的识别、T细胞和B 细胞的激活和产生免疫效应分子P效应细胞。近年来,由于质谱分析日渐体现出来的许多优点(耗样量少、分析速度快、灵敏度和准确度高、可直接分析生物大分子及其复合物等) ,已在免疫学领域里做出了很多重要的贡献,如一系列基于质谱技术的分析方法、研究对象不断增多,包括病原体鉴定、抗原表位分析、抗体的分子质量测定及结构分析,免疫复合物分析、抗原的加工递呈,免疫应答及疫苗的开发等等,这些研究结果大大地帮助人们理解正常的及病理的免疫反应相关机制。本文对生物大分子质谱在免疫学中的应用、涉及的分析方法及其进展
作一综述。
一、抗原的分析
      一般而言,抗原是指能刺激机体免疫系统引发免疫应答而产生抗体和(或) 效应淋巴细胞,并能与之发生特异性结合的物质,是免疫应答的始动因子。蛋白质抗原含有包括连续表位和不连续(或构象) 表位等多个表位,而每一表位都能被具有在形状和结构上互补结合域(抗体结合部位) 的抗体分子识别。

      1、抗原的鉴定:小分子热休克蛋白alpha B-晶体蛋白在多发性硬化中是一个自身抗原,而在自身免疫病中明胶酶B 是一种蛋白酶,Starckx 等用明胶酶B 酶解人alpha B-晶体蛋白,然后用质谱和肽测序分析法鉴定了它所有的酶切位点,发现alpha B-晶体蛋白的肽段1～16 可引起强的T 细胞反应,且明胶酶B 能从完整的alpha B-晶体蛋白中释放T 细胞表位,但它们的致病机理还没弄清楚。结核分枝杆菌蛋白的鉴定对发展有效的疫苗很有必要,因此Flyer等用免疫亲和色谱从感染了结核分枝杆菌的细胞中分离HLA-A * 0201-肽段复合物,然后质谱测序所分离的肽段。结果表明,由Rv0341 基因编码的蛋白是一个Mr 为43. 9 ×10³ 的479 个氨基酸组成的蛋白,并鉴定了单一结核分枝杆菌蛋白( 分枝杆菌Rv0341 基因编码) 的3 个肽段,发现所鉴定的这3 个肽段具有抗原性。以前有人发现狼疮病患者TH 细胞的主要自身表位在核小体的组蛋白中, Kaliyape-rumal 等从鼠科狼疮APC 的MHC Ⅱ分子中提取肽段,然后用反相高效液相色谱( reverse high performance liquid chromatography , rHPLC)-质谱联用分析了其它的表位,发现了3 个新的自身抗原表位,其中有2 个表位是和脑转录因子BRN-3 同源的,第3 个和组蛋白H1′(22～42) 同源。单抗A6H 可以共刺激一个T细胞亚群,能与肾细胞癌高度反应,然而对A6H 识别的抗原一直没有得到鉴定,所以Hass 等用A6H-琼脂糖从肾细胞癌细胞系(1860) 中提取抗原,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE) 分离,Westernblot 检测该蛋白Mr 约为120 ×10³ ,切下该蛋白条带进行胶内酶解,LC-MSPMS(色谱-串联质谱) 分离分析得到的肽段,发现该抗原是二倍肽酶Ⅳ(DPP Ⅳ) ,是分化抗原CD26。
      2、抗原构象分析:由于小肽段刺激产生的抗体能与完整蛋白质的同源序列发生反应,因此利用B-或T-细胞表位的肽段去激发免疫反应已引起了很大的兴趣。然而对这些肽段而言,要激起免疫反应,在溶液中就必须有稳定的构象,因此对抗原的完整描述应该包括对它的三维结构的研究。随着ESI 技术的出现,分子无损地直接从液相到气相已成为现实,因此质谱在研究蛋白质的构象和折叠方面起着越来越重要的作用,Schweda 等用ESIMS 分析了由非典型嗜血杆菌流感病毒株176 表达的脂多糖低聚糖表位的结构。氢氘交换(HPD 交换) ESI2MS是研究合成肽构象的有力工具,反向的DPH 交换可用来解决由于交换实验中富含H 的水带来的问题:在反交换之前,将乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase , LDH) 的天然肽段和合成肽段的所有可标记的部位用氘标记。实验表明,合成肽段比天然的肽更易于维持构象,且将单个赖氨酸残基用脯氨酸代替即可破坏合成肽段的构象,另外,根据保留在每个肽段中氘的量可以测定螺旋的含量。根据变性后多电荷离子峰相对强度的变化,用ESIMS 可时间分辨动态地研究蛋白质的折叠。也有人在ESIMS 中以氧气作为雾化气,利用高电压下蛋白质的氧化反应来探测蛋白质的结构。
      3、其它:为定义细胞免疫反应中抗原结构组分的作用,Romain 等用ESIMS 研究了从结核杆菌中分离出来的复合物的去糖基化,结果表明它可降低体内和体外诱导细胞免疫反应的能力。Lewis 等鉴定了人鼻病毒蛋白VP4N 末端的翻译后修饰。Lopez2Marin 等用MALDI-TOF MS 研究了绦虫中主要醣脂类的结构及其抗原性。Morinaga 等用MALDI-TOF MS 测定了番泻苷B ( sennoside B) 和BSA
的结合物中半抗原的密度。
二、抗体的研究
      抗体是免疫应答的重要产物。所有抗体分子均由2 条相同的重链和2 条相同的轻链通过二硫键以非共价相互作用连接起来。重链约400 个氨基酸(Mr 约55 ×10³ ) ,轻链约200 个氨基酸( Mr 约24 ×10³ ) ,重链和轻链的可变区使抗体能与不同结构的抗原相结合。根据重链恒定区的结构不同,人的免疫球蛋白可分成5 类: IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。
      1、分子量的测定:完整免疫球蛋白的大小对质谱分析提出了很大的挑战。大多数质量分析器的质荷比(m/z) 是有限度的(一般< 5000U) ,因此,这些分子除非以多电荷离子(z > 30) 存在,否则它们难以被检测。ESI 技术的多电荷现象允许用有限质量范围分析器的质谱分析抗体或它们的片段。TOF 仪器理论上有无限的质量测定范围,因此在这方面的研究中也发挥了很大的作用。Nelson 等用MALDI-TOF MS 直接分析了IgM,但仍需进行很大的改进。正常血清中含有大量的自身抗体,而这些自身抗体能掩饰许多重要的与之相关的疾病,另外,Western blot 是分析自身免疫疾病中自身抗体常用的工具,但它非常耗时且灵敏度也很有限,因此,Grus 等用表面增强激光解析P离子化( surface2enhanced laser desorption/ ionization , SELDI)-TOF MS 分析了自身免疫病中的自身抗体,并与Western blot 分析进行了比较,发现在较高Mr 处( > 30 ×10³ ) ,该法灵敏度与Western blot 差不多,但在低Mr 范围,该法明显优于Western blot 。
      2、翻译后修饰分析:Siegel 等用ESI-MS 测定了完整的单克隆抗体和它们共价修饰后的衍生物。MALDI-MS 也可用于研究免疫球蛋白中糖基化的层次,免疫球蛋白糖基化的不同程度会对免疫反应产生不良影响,并与疾病的进程有关。Hiki 等的研究表明,肾病病人IgA 中糖基化的程度与正常人有很大差别。Lapolla 等用MALDI-MS 比较了健康人和糖尿病人中IgG糖基化的程度,发现IgG的Fab 和Fc 片段的质量增加了,糖尿病人免疫缺陷可能是由于修饰后的IgG Fab 片段的功能发生了变化,从而导致抗原-抗体之间的分子识别受到抑制。
      3、结构分析:用质谱可研究抗体的表面拓扑结构,氨基酸残基的侧链可以通过限制性的酰基化或烷基化被化学修饰,然后根据观察到的酶解产物的质谱图中修饰了的和未被修饰的相对离子丰度可以测定特殊氨基酸侧链的反应性,该法可与HPD 交换质谱法互为补充。Zappacosta 等选择性地化学修饰氨基酸侧链,用质谱方法研究了minibody 的表面拓扑,并用一系列酶限制性酶解同一minibody,发现当保持抗体的天然状态时,在分子表面的酶切点更易于被酶解,但酶解只发生在分子有限的几个位点上,酶切的特异性也受那些位点附近的氨基酸性质影响。Sun 等研究了鸡抗狂犬病毒抗体(antirabies virus immunoglobulin Y, IgY) 的结构并与哺乳动物的IgG进行了比较,发现有2 个结构上的差别: IgY其重链大于IgG,轻链则小于IgG; IgY用胃蛋白酶酶解后产生Fab 片段, 而IgG 在同样条件下得到F(ab′)₂ 。
三、抗原抗体复合物
      抗原抗体之间特异性相互作用对许多生理过程,如免疫反应和信号传导很重要,因此,全面理解关于分子层次上抗原P抗体相互作用特别是识别的结构区域的信息非常必要。抗原-抗体复合物通过非共价作用(静电作用、氢键、疏水作用和范德华力等) 结合,是一个可逆的过程,由平衡常数Ka 可测定结合的亲和性。一般的抗原抗体间反应的解离常数> 10⁹L/mol ,这是已知最强的非共价相互作用。尽管非共价复合物的质谱检测很具挑战性,但还是有人分析了蛋白-蛋白及其它大分子的非共价复合物。对抗原-抗体复合物的分析有两个主要难点: ①非共价复合物相对不稳定,易解离,复合物能稳定存在的条件与质谱分析的最佳条件不匹配,如质谱在酸性及有机溶剂存在条件下离子化效率较好,但这时复合物有可能已解离,且气相的复合物是无溶剂分子,至少缺溶剂,因此其结构特征可能与溶液中观察到的不同。②对大多数质量分析器而言,完整的抗原-抗体复合物的Mr 大小无论在质量测定范围还是分辨率上都是一个很大的挑战,因此可将抗原或抗体降解成更小的亚单位结构再质谱分析。
      1、化学计量的测定:体液免疫反应的一个主要特征是抗体能与抗原分子的表面区域特异性结合,从而根据抗原抗体相互作用的特异性利用免疫亲和性技术可选择性地分离抗原,并识别免疫反应中重要的抗原决定簇或表位。Borchers 等用MALDI-MS研究发现,包膜糖蛋白gp120 和T 细胞受体CD4 形成的1∶1 复合物在HIV 感染中起主要作用。Janna等研究了A 型流感病毒的红血球凝聚素抗原与单抗IVC102 所形成的1∶1 非共价复合物,并分析了其抗原表位肽段。
      2、表位分析:由于抗原抗体只在具有合适的构象时才能在机体内产生合适的免疫应答,因此抗原抗体反应复合物的表位分析也是目前的一个热点问题。SH23 和SH24 单克隆抗体能识别人间叶干细胞(MsCs) 表面的抗原表位,但具体针对什么抗原不清楚,Barry 等通过免疫沉淀,用SH23 抗体从MsCs 细胞膜裂解成分中获得一个Mr 为67 ×10³ 蛋白,用MS 肽谱和序列鉴定为CD73 ,他们发现SH24 可以识别纯化的牛CD73 ,但SH23 不能与牛CD273 反应,所以SH23 和SH24 识别的是CD73 上的不同表位。利用质谱方法分析抗原-抗体复合物的表位肽段一般采用以下几种分析方法:
      (1) 需预先将抗体固定的方法:将酶解后的抗原肽段或未被酶解的抗原与固定化的抗体一起孵育,然后用MALDI-TOF MS 测定表位肽段,该法可测定连续的和不连续的表位。Natsume 等将抗谷胱甘肽-S-转移酶(GST) 的抗体固定在表面等离子体共振生物传感器芯片上以纯化低浓度的GST ,然后用MALDI-TOF MS 测定纯化后的重组蛋白的Mr ,并动态分析了和抗体结合的表位。Baerga-Ortiz 等通过HPD 交换和MALDI-MS 联用的方法测定了抗人凝血酶的单克隆抗体的构象表位,发现该表位由两个肽段组成。
      (2) 无需固定抗体的方法: ①需预先分离肽段的分析方法: 将抗体-肽段复合物的表位肽段用色谱或微孔过滤等方法与非表位肽段分离,然后解离并质谱分析该表位肽段,这样可简化质谱分析过程。Lyubarskaya 等将毛细管电泳和质谱联用,通过观察表位肽段信号的缺失情况而鉴定抗原连续表位。②无需分离,直接分析的方法:该法无需将抗体-肽段复合物从反应混合物中分离,而是通过直接比较酶解肽段与单抗反应前后的质谱图中离子相对强度的缺失或减小而测定表位肽段,通过控制抗原酶解和它与抗体反应的先后顺序,可用于鉴定连续的和不连续的表位。Kiselar 等用该法直接检测到单抗和从流感病毒表面抗原上获得的肽段之间可形成1∶1 的复合物,该肽段包含一个可被抗体识别的血凝素抗原的决定簇。
四、抗原加工及递呈与疫苗研制
      1、抗原加工与递呈:和B 细胞不同,T 细胞通常不识别游离抗原,而是识别由抗原递呈细胞提交的被加工过的抗原片段即抗原肽。且这一识别受MHC的约束,有辅佐分子的积极参与。因此,在T 细胞和抗原递呈细胞(以及和靶细胞) 之间就形成了一个以TCR、抗原肽和MHC 为主要成分的三元体,即抗原-MHC-TCR 三分子复合结构。若抗原在细胞内合成,肽段连接到MHC Ⅰ分子上,若是外源性抗原,肽段连接到MHC Ⅱ分子上。与MHC Ⅰ和MHC Ⅱ分子结合的肽段一般用免疫亲和技术分离,样品的复杂性和低丰度曾对分析技术提出了挑战,但质谱与HPLC 联用为此提供了较好的方法。有研究表明,HLA-DO在B 细胞中被选择性地表达并阻碍DM 的活性,但它在生理学上的作用仍未知。Van 等的分析结果表明,DO 可影响MHC Ⅱ相关的肽段库,并可抑制大肽段的递呈。Dongre 等用ESI-MSPMS 分析了鼠MHC Ⅱ分子递呈的个肽段序列,包括从自身胞质溶胶蛋白质中获得的大量肽段。Brichory 等用质谱方法鉴定了在肺癌中通常诱导抗体反应的蛋白质,发现蛋白基因产物9. 5 (protein gene product 9. 5 ,PGD9. 5) 作为肿瘤抗原在肺癌中可诱导体液免疫。
      2、疫苗的研制:尽管存在挑战,合成肽段的疫苗很有应用前景。含B、T 细胞决定簇的肽段,特别是那些含有能与几种MHC 分子反应的T 细胞决定簇的肽段,是有效的免疫原。例如,从猴子中获得的含有与疟疾( Plasmodium f alciparum malaria) 相关的氨基酸序列的肽段混合物可以在一定程度上保护猴子不得疟疾,而且根据这些序列化学合成的SPF66 作为疫苗也具相同的作用。另外,由于免疫后DNA 是长期存在的,免疫反应具持久性,对防治由不断变种的病毒引起的疾病如HIV 和流感很有好处,因此,DNA 疫苗的研制具有很好的应用前景,但DNA 作用机制仍不清楚,且DNA 疫苗广泛应用的安全性和有效性仍有待于进一步研究。Sanger 双脱氧链终止序列测定方法是目前常规的DNA 序列分析方法,但该技术比较费时,试剂消耗比较大,应用于快速分析和临床分析有一定的困难。然而,利用现代生物质谱技术,不但能得到寡核苷酸的分子质量,能通过相关的技术得到它的序列信息,而且质谱分辨率的提高和串级质谱解谱技术的发展有可能将质谱DNA测序由研究推向实践应用。目前,质谱DNA 测序通常采用以下三种策略:梯度测序、Sanger 产物的质量分析和气相裂解测序。因此,用质谱研究核酸方面的新进展将有助于这方面研究的开展。
五、小结
      对免疫反应的进一步理解对发展新方法以预防和治疗疾病是很有必要的,因为只有当抗原抗体以合适的比例结合在一起,具有特定的结合常数,分子构象及抗原的加工递呈方式等才能在体内产生合适的免疫应答。而随着生物质谱技术的不断发展,灵敏度高、分析速度快、且能在不破坏生物大分子的非共价结构的前提下检测Mr 达n ×10⁵ 的生物大分子,已经在研究包括抗原抗体及其复合物在内的生物大分子的结构方面展现了很大的优势,为研究蛋白质功能,药物机制及生理过程等作出了重要的贡献,并将发挥更大的作用。

                                                                             编辑：范伟伟