对先天性新陈代谢缺陷和新生儿（血斑）筛查中实验室问题的临床看法

串联质谱法和其他技术的发展，使检测的临床敏感性和特异性已经有了长足的进步。性能特性已经完全可以胜任小型血液样品中的代谢生物标志物的测量工作，可以在新生儿阶段立即进行先天性代谢缺陷（IEM inherited error of metabolism）的诊断。越来越多的代谢疾病在发病之前就能够得到确诊，使临床医生有机会阻止心脏病等疾病的发生。这在以前不具备这样条件的时期是不可想象的。随着越来越多的生物标志物被发现和识别，越来越多的代谢疾病在早期就能得到诊断。

新生儿筛查和后续诊断的作用包括：带有期望的积极效果和健康结果的先天代谢疾病早期诊断，以及进行适当的治疗，适当治疗的发展进步与实施。由于实行正确的诊断和治疗，许多疾病的发病率在实际上会大大降低，这些疾病包括：先天性甲状腺官能不足，囊性纤维化，苯丙酮酸尿症（PKU）以及镰状细胞疾病。事实证明，技术的进步近年来使一些疾病的诊治受益良多，例如：脱氢酶缺乏症（MCADD）和戊二酸血症1型。另一方面，鉴别症状轻微或者无症状的患者会导致伤害和不必要的治疗及诊断活动，使患者尤其是婴儿遭受不必要的焦虑和痛苦。

美国政府最近组建了新生儿和儿童遗传疾病部长级咨询委员会，该机构由政府负责管理，对新兴诊断治疗条件进行提出，筛选和审查，审查的内容和标准如下：1 诊治条件的强度和严重性；2 初级和二级测试敏感度和特异性的临床可实现性；3 治疗形式的有效性和可实现性。

这些条件进一步的发展必然期望治疗的有效性，因此，建议用具备更佳临床敏感性和预测值的新的生物标志物和测试技术筛查新发现的疾病类型及其子类型。

需要认识到的是：IEM的诊断测试仍然面临巨大挑战；执行生化遗传测试时，需要进行良好的实验室实践以及明确IEM后续测试实践所面临的挑战。

Carol Greene博士毕业于马里兰州立大学医学院，现就职于堪萨斯城巴尔的摩市儿童慈善医院。Greene博士在2013AACC年会中就“先天性新陈代谢缺陷和新生儿（血斑）筛查（NBS）中实验室问题的临床看法”进行报告。

报告话题概览和报告的目标：首先需要理解的问题有新生儿IEM筛查原则；新生儿IEM筛查和测试过程（患者和实验室因素的敏感性）以及理解其他用药原则。其次，与IEM和NBS相关实验室测试执行医师进行交流。最后，讨论当前生化遗传测试和新生儿筛查面临的问题和争论及其对实验室的影响。

一、通过新生儿筛查实现更好预后的原则

该原则的目标是在新生儿发病前，对其实行鉴别，找到具有潜在发病可能的婴儿，进而达到防止发病并阻止新生儿死亡的目的。这也是临床诊断的目的-疾病对患者引起实际的伤害前进行诊断并干预。在这个过程中需要医师，患者以及患者的家人通力协作。

二、与IEM和NBS相关实验室测试执行医师进行交流协作

作者列举了两个例子强调协作的重要性。

（1）作者从另一名医师（另外一个遗传实验室领导者）处了解到一个案例：作者和那位医师认为受测的婴儿为三体综合症。如果该婴儿为三体综合症，那么对疾病的管理将会产生重大的改变。因为这不是代谢疾病或其他遗传疾病。90%患有三体综合症的儿童会在1岁内死亡，使其家庭遭受重创。因此决定对该婴儿进行手术。后来作者又打电话联系那位医师了解到，如果不是和作者进行了医师间的交流，极有可能对患儿造成误诊。作者在此强调了医师和实验室之间交流的重要性。医师在做出诊断时应小心谨慎，充分考虑所做诊断导致的后果。

（2）作者的另外一个例子是关于一个病情特殊患儿的样品需送检，但这需要大学实验室的帮助。但是大学实验室在周末不工作，在一名医师的帮助下，工作才得以完成。作者在这里强调的是医师之间，以及中心实验室，大学实验室等机构之间的合作。大部分的时候，样品的检测在本地实验室完成，但有些时候需要送交其他外地机构去完成，这要求实验室之间，医师之间以及医师和实验室之间要进行协作，为患者及其家人服务。

作者列出了医师和实验室工作人员面临的日常问题。例如医师可能会遇到的问题有：采集了错误的样品；样品标签错误；请求了错误的测试；在事先未进行说明和通知的情况下，希望实验室自行了解相关情况；认为实验室规则和程序是武断的，这些程序仅是实验室工作人员工作方便（这是医师对实验室规章和程序的误解）。对于实验室工作人员可能会遇到如下问题：将全血冷冻了；拒绝和抛弃了本应该合格样品（独一无二的不可替代的样品）；运行请求的试验失败；替代错误的测试；凭主观臆断认为医师很懒惰，不愿意采集另一个样品（这是实验室工作人员对医师的误解）。

医师和实验室工作人员应该严格按照规章制度做事，因为规章制度的制定是为了严格地保证患者的生命健康安全；其次是医师和实验室工作人员之间要加强沟通，不要推卸责任或者凭主观臆断相互误解。在这里作者举出另一个例子：一名患儿的样品送交实验室检验，但实验室经检验认为样品不合格，需要医师提供另外一个样品。但是患儿的样品采集本来就很困难，医师很难再次获得样品，但是实验室技术人员根据规定认为没有样品就不能检验，最后双方进行沟通，由实验室领导进行协调处理此事。作者在这里强调的是医师和实验室之间要加强沟通，通力协作。所以作者提出不要认为“这有什么可大惊小怪的？”，而是如何能够进行协作。

（一）IEM的概念及其导致的后果

在此作者进入IEM的正题，提出什么是IEM以及能导致何种后果的问题。IEM是一种生化途径的遗传变异。代谢障碍可能会影响生理机能导致紊乱，这种影响有时候是有毒的，后果就是患有IEM的患者可能在数小时之内死亡，一些患者接受及时治疗可以被成功治愈。如果治疗失败，就要尽可能地理解预后情况。如果能够治疗成功，才有可能避免“诊断反复”-包含许许多多复杂昂贵的测试，这些测试这与遗传有关。家庭中的其他人均有可能受到影响而发病，IEM表现为脓毒病、中毒、脑炎、心肌症或其他表现，有记录的代谢疾病大约有350中，个例很罕见，在总人口中的发病率大约为1%。实验室能够告诉我们谁患有IEM以及我们尚未了解的IEM导致的后果。

1、关于PKU

苯丙酮酸尿症（PKU）并不是研究者最早发现的IEM疾病，但是却是现今能够得到很好治疗的IEM疾病之一。

图1（上图）左图中左边的男孩罹患PKU情况十分严重，但是右边他的妹妹已经经过治疗，二者反差极为明显。右图中中间的女士曾罹患PKU，这是她经过几年后的恢复情况。患者病情得到有效控制，恢复良好且已经怀孕。患者所怀的婴儿有一定风险，尽早进行治疗，不会再罹患PKU。

如果IEM未诊断出，则可致命，但IEM可以治疗，以下为MCAADD范例——MCADD中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症（Medium Chain Acylcoa Dehydmgenase Deficiency）。

图2为来自94个家庭106名有MCADD缺陷患儿的发病年龄和发病率。横轴为发病年龄，纵轴为患儿数量。每个方框代表一名患儿。白色方框为首次发病仍然存活的儿童，黑色为首次发病死亡的儿童，灰色为首次发病存活但后续发病死亡的儿童，方框内标出的是死亡的月龄。MCADD典型代谢病症状的过程为：过敏，活动性减弱，昏睡，昏厥，抽搐，死亡。

我们都希望通过新生儿筛查进行诊断，基于准确的诊断对患儿进行治疗，可以避免患儿死亡。治疗的过程并不复杂。但是如果缺乏诊断，患儿就很有可能死亡。这就是代谢病诊断研究非常重要的原因。即使患儿濒临死亡或者发病，但是可以从急诊室逝去的患儿和发病的患儿处获得样品进行研究，这样的样品往往已经不能再次采集，但是却有助于拯救更多的患儿。例如，逝去的患儿有个两岁的妹妹，她有可能潜在具有25%的患病几率,但是医师却不知道。通过逝去的患儿的样品，医师可以为逝去患儿的妹妹做诊断，并拯救她的生命。另外一个例子是：对五个月大的婴儿进行采样，这样的婴儿年龄太小，采样可能有危险和困难。但是众所周知，还是进行了采样。这样做的原因是：尽管流感会影响所有人，并不是所有人都会死于流感，但流感会杀死婴儿。这就是尽管代谢疾病很罕见，但是医生为何一直从事这类罕见生化疾病的测试呢？

临床观点得出的重要原因是存在其他不能排除IEM可能性条件的证据。例如：患有乳糖血症的患者大肠杆菌败血症发病率上升；轻度传染性肝炎或者流感可以成为MCADD代谢性失调首次发病的诱因；有机酸或者其他IEM可增加过敏和非偶然性创伤的风险。

2、MCADD的管理

MCAD管理，管理可以简单有效。对于急性患儿，要考虑的葡萄糖静脉注射的水平而不是患儿的饮食情况，肉碱以及发病诱因疾病的治疗。如果在脑损伤发生前得到治疗，患儿是可以完全康复的。对于慢性患儿，需要避免进食，这包括频繁进食和睡前进食，适当多进食碳水化合物，补充肉碱以及咨询：家庭筛查。实验室人员已经了解了诊断工作，但他们仍有疑问：为什么不能再送一个样品来呢？在这里作者的回答是无法进行再次采样，也许可以进行DNA测试，但是DNA测试并不是特别重要。以下为急性IEM患者的实验室测试。

基础测试，包括：葡萄糖，CBC，电解质，肝功能以及肌酸磷酸激酶；氨；血清氨基酸（定量VS定性）；尿氨酸；尿液有机酸；酰基肉碱概况；保存MCAD急性症状血浆和尿液；特殊研究，例如：乳酸盐，血肉碱，总量和游离量；戊二酸定量以及临床表现参照。这些测试中，有些在任何时候均是可靠的，但有一些仅具有实时的可靠性。为什么医师进行另一次测试如此的困难呢？实验室的检测都是定时的，但是对于生理机能的检测需要实时检测，送检的样品不可能反映急诊室中患有临床急性病症患儿的生理机能。医师为何关心数据来自哪个参考实验室呢？作者以粘多糖代谢病为例做了解释。

3、粘多糖代谢病

粘多糖代谢病-导致大脑或机体二者或二者之一功能退化的疾病。如果不进行治疗-该类疾病中的一些特例目前也没有有效疗法，则会致命。测试尿液粘多糖（尿液MPS，也称为GAG）测定乙酰肝素，皮肤素和/或硫酸角质素。大多数实验室“尿液MPS”为“血斑”或者“GAG定量”由于硫酸软骨素的影响，普通患儿测试可能出现阳性结果。少数实验室可以描述MPS的本质特点（通常通过TLC）描述。送交到实验室或者合约实验室的样品通常不能自动反映阳性MPS血斑表述的意义，还可能需要以下步骤：医师召集患者家属，需要采集其他尿液样品；在等待结果的同时，患者家属需要读取全部的MPS。

（二）实验室关于脂肪酸的发现

当MCADD患者发病后，他们可能出现非正常的低酮症和中链脂肪酸上升，其他的症状则是可变的，例如：低血糖症，酸中毒，高血氨症，继发性肉碱缺乏症和肝酶上升。这些症状可导致死亡。即使MCADD的病情好转，还是会导致中链脂肪酸上升。在VLCAD中也有类似发现：不可变症状为：非正常的低酮症和中链脂肪酸上升，可变症状为：低血糖症，酸中毒，高血氨症，继发性肉碱缺乏症，肝酶上升以及CPK上升。即使VLCAD好转，还会出现长链脂肪酸上升和低肉碱症状。作者提出可以回头对患儿进行二次采样，试验并诊断，但是不能对好转的患儿进行试验。好转说明VLCAD的症状完全消失，各项指标完全正常。对其进行采样可能会与未好转患儿的样品混淆，所以不能在他们身上进行试验。采样和试验只能针对患病儿童。但是在临床和管理方面还是有许多的事情要做的。

即使不能使用样品，但是还是有许多方法可用。作者认为可以对急诊室的患者进行编号，观察重复出现的症状。确保患者的编号顺序是正确的，如图3所示：

通过这种管理可以了解患者概况，监视患者状况还可以根据上述情况做出快速的临床诊断，这种诊断可以在急诊室已经做出测试的情况下，通过临床诊断出具备潜在风险的患者。这是令人兴奋和激动的。作者先前提到过DNA测试不必要且不敏感。但除此之外，DNA测试可以作为对单独个体的管理策略。大家都担心具备潜在风险的患者会向代谢疾病的方向发展并转化。快速诊断是一项挑战，但是通过快速诊断，可以了解患者的孩子以及亲属的潜在风险，并对这一个家庭中的所有人实行有效地监控和管理。

作者认为有效的管理其实还是具有挑战性，可是目前也没有很有效的解决方法。但是作者希望其提供的管理方法能够改进慢性疾病检测医疗记录并有助于诊断。如何对生化遗传实验室进行管理，也是听众所面临的问题。作者可以提供一些附带全部临床信息的样品，因为一些中级实验室不具备接受并处理全部信息的能力。Chen教授接下来会发布一些信息，这些信息中的一部分由良好的实验室实践得出的。但是医师的一方需要了解的是实验室的信息网络系统不支持所有的其坚持发送过来的额外信息。这些信息如：采样时间的临床状态，包括妊娠年龄，哺乳和呕吐。这对解析尤其是敏感性分析尤为重要；血统/种族/民族，由于血统的不同发病频率不同，药物列表，由于多巴胺和肿瘤特征，HVA上升；其他实验室测试结果，血液和髓液的比值等。这些信息有些可能缺乏临床状况，有的和药物和血统相关，这些都会被特别说明是否可用于其他种族或人群。

这就是为什么新生儿筛查会包含诸如：结果必须清晰易读，被采样患儿的年龄，选定样品的处理时间，采样患儿出生处理时间以及第一次喂食的时间等等。新生儿筛查需要确切明晰多种数据。

三、讨论当前生化遗传测试和新生儿筛查面临的问题和争论及其对实验室的影响

（一）新生儿（血斑）筛查（NBS）的概念

新生儿筛查是一项减少新生儿死亡，智力障碍和生理残疾的公共健康计划。它是一个包括测试，跟踪，最终诊断，治疗和长期管理和评估在内的保障系统。绝不仅仅是“PKU测试那么简单”。

筛查和诊断测试的比较，筛查测试是为了从那些不太可能得病的患者中区分有可能或很有可能患病的潜在人群。最终诊断测试是对特殊患者患有的特殊疾病做出的最终诊断。比筛查测试更具侵入性且更加昂贵。

在关注生理学的时候，不可避免的要谈到临床敏感度和临床特异性（见图4）。如果得到一组生化测试和生理学的正常值范围，在特定健康人群和受影响人群中，在特定的时间，在100%特异性和100%敏感性测试之间会有一个交叉重叠。诊断者可以在其确定的地方设置截点。在这个重叠区域内，诊断者会发现在本来正常人群中会出现很多的非正常人群。因为在这个区域内存在大量的假阳性特例。所以诊断者必须在其确定的地方设置截点，这样会尽可能地减少假阳性，但是还是会错失一些受影响个例。对于每个实验室中的每个测试，测试者都在努力尝试设置最佳的截点，将患病患者人数最大化诊断出来，并将假阳性数量最小化。众所周知，在大多数的生理学体系中，敏感度的增强会降低特异性。

范例-全部工作理想的完美完成范例-1

产科医院及时采集样品并快递到州立实验室；州立实验室按时测试并且患儿上升到C3；州立实验室召集遗传学专家，并研究患儿及其母亲的初步护理；患儿在急诊室内的停留时间在1小时内，苏醒，轻度改变喂食模式，对其双亲和急诊室内的其他人反应正常。

范例-全部工作理想的完美完成范例-2

急诊室采集血液和尿液进行诊断和临床评定；急诊室主治医师和遗传专家使用3cc尿液进行临床诊断和评定；急诊室内的实验室技术人员遵照请求每个涂版使用1滴尿液；尿液立即显示酮类4++++；患儿开始葡萄糖静脉注射；血液碳酸氢盐为7；结果：该范例设计的婴儿康复，已经7岁且很漂亮无任何后遗症。

假阴性的问题。作者已经获得授权允许使用这个男孩的范例进行教学（见图5）。图5左上角的图片是孩子的母亲在孩子出生后拍摄的，左下的图片是孩子目前学校的状况。作者在孩子出生后不久发现了这个孩子有一些不正常的生理现象和特殊的疾病症状。新生儿筛查显示孩子情况很好，类似状况罹患代谢疾病的可能性很低。患儿在7个月的时候还通过了较好的实验室进行的筛查和临床测试。但是从右上角的图片得知在该图片拍摄2周后孩子罹患中风。新生儿筛查并不是结束，在临床上还有更多的事情需要去做和注意。以下列举的是一些假阴性结果的来源：生理上的，包括喂奶不足：出院太早；母乳喂养不足/缺奶；注射：注射会影响血红蛋白，生物素酶和半乳糖测试；操作者失误。

对于筛查计划，美国，欧洲，英国，澳洲以及日本等世界上许多的国家均会执行新生儿筛查，以下是筛查的典型方案：初步筛查或者单一筛查：新生儿出生24小时后，出院回家以前；（1）慢性活动性肝炎（CAH）检查，T4低敏感度/特异性测试，在24小时内执行。（2）仅婴儿年龄24小时以上且喂养至少24小时的情况下，执行有效的半乳糖和氨基酸测试（尤其是结果为阴性时），快递到实验室进行快速检测；第二次筛查（全部婴儿的常规筛查或每名医师的例行筛查）：采集7-10天年龄之间婴儿的样品（首次获取通常在儿科）；挑选出重要性%（即：15%）的甲状腺功能减退案例；第一份标本可能用于鉴别大量的假阳性案例；样品可邮寄但是推荐使用快递。

（二）新生儿筛查的工作流程图

1、病情通知的作用

病情通知的作用包括：决定筛查小组；确保为婴儿提供筛查无论其是否负担得起；确保跟踪全部结果不正常的婴儿；确保全部患儿得到迅速和适当的治疗，无论其是否负担得起；确保患儿得到长期适当的保障。

2、选择疾病进行筛查的传统标准

这些标准包括：相关“高”频率/负担的疾病；疾病可以得到治疗；疾病试验方法成熟；试验耗费低且有效；当前联邦检测程序支持的且美国核心条件覆盖的NBS检测。

（三）美国各州2009年新生儿筛查检出疾病数量

图7显示美国2009年各州新生儿筛查检出疾病的数量。有些州的数量超过50，有些州在40-49之间，这都需要密切关注。有些州数量低于39，并不是这些州不重视筛查，而是筛查的标准不同。有的州仅检查专家组列表上的检测项目，还有一些州将常见度比较低，但是标志物能够预测的疾病都列入检测的范围内。实验室检测52个疾病项目和检验49个项目的测试其实没有什么不同，还很可能得出相同的结果。

1、公共健康平衡活动

检测出现了假阳性会造成患儿家属焦虑，重新测试无端增加花费，影响人际关系，重新采样造成患儿痛苦，为医师和家庭带来诸多不便。而假阴性结果使本来患病的儿童未被鉴别出来，得不到理想治疗，造成更加严重的后果。所以该计划旨在尽可能消除假阴性，同时尽可能控制假阳性。

（四）医院（临床单位和实验室）的职责

医院的职责在于：向家庭普及新生儿血斑筛查的知识；完整填写表格；确保标本的适当性和时效性；采集新生儿筛查标本；在24小时内将标本快递到实验室；有需要时，紧密协助跟踪团队工作。

（五）新生儿筛查程序

1、温暖婴儿的脚踝；2、尝试使用重力；3、利用重力下压刺血，

然后用标本卡吸收血液；4、风干并运送到实验室。

医院负责标本的采集，要绝对保证进行单次采血，集中大批量采血会导致婴儿死亡。多次有间隔单次采血后，组合在一起快递到实验室。利用重力的意思是将婴儿的脚踝抬高，将标本卡放到脚踝顶端，使脚踝自然下落刺破皮肤获得血液，与直接刺破差别不大，只是较为自然。

（六）标本采集规范

该规范对医院明确了医院的职责：医院负责采集；婴儿喂食24小时后方可采集；采集量要充足还要保证质量（风干）；完整填写人口调查统计数据协议；在24小时内将标本快递到实验室：

（1）严禁大批量采血；

（2）初始测试结果正常婴儿的常规第二次采集的标本可以邮寄到实验室（在此情况下可不使用快递）；由于疾病的不同理想的标本采集时间亦不相同。

（七）新生儿重症监护室（NICU）的患儿何时执行新生儿血斑筛查？

对于特护婴儿室（SCN）和新生儿重症监护室（NICU）内的患儿分别执行不同的安排。第一次NBS应该在进入SCN或NICU之后立即进行采样。该标本应在进行输液或注射前采集。注射会影响血红蛋白，生物素酶和半乳糖测试。第二次NBS标本应在婴儿2-3天龄时进行。第三次NBS应在婴儿10天龄时采集（如果婴儿状况良好可以出院可在10天内采集）。第四次NBS标本应在婴儿1月龄时采集，如果婴儿已经出院可在1月内采集。

（八）儿科医师的职责

儿科医师的职责包括如下几点：指导婴儿的家人；在第一次访问时检查筛查结果并提取第二次常规测试标本；等待并观察结果；理解适当区分阳性筛查的方法学；根据筛查结果迅速并适当地做出处置；有需要时求助：（1）查阅处置工作表；（2）联系州卫生部门；（3）联系相关专家。

（九）实验室的职责

实验室的职责应包括：接收标本；执行实验室测试；报告结果：（1）正常结果：报告正常结果到医院（以及儿科医师）可使用邮件或传真；（2）异常结果：立即通知跟踪团队，通知医院及儿科医师（在特定情况下通知家属）可使用电话等方式。

（十）紧急状况

关于紧急状况的处理首先是半乳糖缺乏导致的阳性筛查，这也是半乳糖症的发病原因。下一步是观察半乳糖的含量低的水平，以及其导致阳性结果的变化。许多实验室不对血清中的半乳糖进行判断，但是还有许多实验室对半乳糖进行定量，这很重要。在得克萨斯，路易斯安那和墨西哥州，标本的时效性暂时得不到保障，在这些地区的干燥炎热气候下，以及该地区邮政条件的不足，标本还是要靠邮车来运输。因此阳性新生儿筛查率在夏季会上升，但是婴儿并不具有传统意义上的半乳糖症。有些紧急事件总是显示半乳糖低，如果半乳糖低，医师就不会终止母乳喂养。因此理解什么测试已经真正完成了是非常关键的。

（十一）关于假阳性的筛查

假阳性的来源有生理因素；药物因素包括使用抗生素；饮食因素包括多种综合配方和开始喂养的定时周期；临床状态包括早产儿，肝功能不全；热量和对湿度敏感的酶；实验室或操作者失误。根据这些来源应采取的策略。降低假阳性影响的策略：减少假阳性筛查的数量；减少+NBS后进行诊断需要的时间（以及减少重新测试数量）；增强和婴儿家人之间的联系以减少假阳性的负面社会心理学影响。

（十二）NBS面临的的挑战

1 当前一些推荐进行筛查疾病的治疗方法不够有效：

（1）在缺乏有效疗法甚至没有治疗方法的前提下，诊断是否对评定筛查具有充分的益处？

（2）减少“诊断式研究”

（3）在进行下一个孩子的筛查之前，允许使用广泛的再现性决议。

2 同一个试验中用于强制性筛查的未知重要性化合物的检测：

（1）载体识别

（2）婴儿双亲关于NBS知识的普及

（3）资金匮乏。

（十三）生化遗传学和NBS实验室测试面临的挑战

1 需要快速和准确的结果，但目前通常使用非最佳样品进行测试；

2 生物化学和生理学的快速变化；

3 患者数量少；

4 测试患者通常为危重患者；

5 对家属产生巨大压力；

6 本地测试不标准，通常需要送检。

（十四）一些解决方法

1 丰富知识；

2 联合领导研究，合作，沟通；

3 良好的实验室实践：

（1）完善生化以及NBS实验室的指南，

（2）综合实验室和生化，NBS实验室以及医师间的交互活动；

4 在职实验室以及临床单位工作人员和医师的培训；

5 加强联络。