生物质谱技术在蛋白质结构鉴定中的研究进展

      生命科学及生物技术的迅速发展，人们开始把生物大分子研究提高到一个新的水平一有机体全部基因和蛋白质集合，这样就产生了蛋白质组学。蛋白质结构是蛋白质功能的基础，是开展蛋白质组学研究的重要方面。生物质谱(Biological mass speetrometry MS)技术，能够准确测定多肽和蛋白质相对分子质量、氨基酸序列和翻译后修饰等，因此，目前成为生命科学研究必不可少的技术。 

1 生物质谱技术

      质谱法分析蛋白质的原理是通过电离源将蛋白质分子转化为离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M／Z)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M／Z值，分析鉴定未知蛋白质。质潜分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级样品提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。所以质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位。
      1．1 电喷雾电离技术(Electrospray ionization ESI)  电喷雾电离利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气或加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生成去溶剂化离子。带电荷的样品离子被静电力喷人气相而进入质量分析器。电喷雾电离的特点是可生成高度带电的离子而不发生碎裂，这样可将质荷比(M／Z)降低到各种不同类型的质量分析仪都能检测的范围，离子真实分子质量可根据质荷比及电荷数算出。ESI 的一大优势是可方便地与分离技术联用，例如在使用ESI 离子化前使用高效液相色谱和毛细管电泳，这样可方便地去除待测物中的杂质。另外，纳米电喷雾电离技术的应用，可减低溶剂流速，以提高灵敏度，但是要求样品容量<1ul 。
      1．2基质辅助激光解吸电离技术(matrix—assisted laser desorption ionization MALDI) 以有紫外吸收的小分子晶体为基质，将待测物分散在基质分子中形成晶体。当用激光照射晶体时，由于基质分子吸收辐照光能量，导致能量聚集并迅速产热，从而使基质晶体升华而将非挥发性待测物释放到气相中。MALDI 是以脉冲离子化方式使样品电离，它常与飞行时间质谱(TOF—MS)联用，称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI—TOF—MS)。基质辅助激光解吸电离质谱技术的开发，大致有2个方向：①通过附加测序能力，具体化其对蛋白质的鉴定；②通过耦合二维凝胶电泳，延展其分析复杂的多肽混合物的能力。
      1．3 串联质谱技术串联质谱主要分为3类，即MALDI 串联两级TOF质谱系统(MALDI—TOF／TOF MS)、串联四极杆—TOF质谱系统(QQ-TOF MS)和串联四极杆-线性离子阱杂交型质谱系统(Quadrupole-Linear Ion Trap MS)，在蛋白质研究领域中发挥着越来越重要的作用，已成为蛋白质组学的最领先工具。蛋白质串联质谱鉴定是利用了肽段氨基酸序列的特异性，其鉴定蛋白质的特异性更高，仅一条肽段就可鉴定蛋白质，可用于蛋白质混和物的鉴定。适当调整后，还可鉴定蛋白质翻译后修饰，它是目前鉴定蛋白质最常用的方法。串联质谱大致分为空间串联质谱和时间串联质谱。离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可在同一个质量分析器上完成母离子选择、存储、分裂和检测工作。单一运用空间串联质谱完成同类工作需要几个分析器。相对地，离子阱质量分析器耦合时间串联质谱，可有效地去除其他碎片离子的干扰，适应在复杂背景下分析。目前，将色谱与串联质潜连用是近年来研究蛋白质组学的新方法。
      随着质谱技术的发展，MALDI 源与其他具有MS／MS功能的质餐分析器诸如离子阱(ion-trap，IT)、混合Q飞行时间(Q—TOF)偶联的研究模式，实现了MALDI源的高通量与MS／MS序列分析功能结合。这类最新的适用于蛋白质分析的串联质谱，具有高灵敏度、高准确度、高分辨率等特点，而且大量数据库和一些分析软件如SEQUEST的应用使得串联质谱可以进行更大规模的测序工作。

2 生物质谱技术在蛋白质结构研究中的应用

      生物MS技术主要用于解决两个问题：一是精确测定生物大分子，如蛋白质、核苷酸和糖类等的分子质量，并提供分子结构信息；二是对存在于生命复杂体系中的小分子生物活性物质进行定性或定量分析。目前在蛋白质结构的快速鉴定、序列分析、蛋白质定量分析、翻译后修饰等方面已有较为广泛的应用。
      2．1 肽指纹图(peptide mass fingerprinting PMF)的测定PMF测定是将未知蛋白质以特定的蛋白酶或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，用MS测得各个肽片段的相对分子质量，将所得到的蛋白酶解肽段质量数在相应数据库中检索，寻找相似肽指纹谱，从而绘制“肽图”，即有可能检索到相应的蛋白质，同时可获得诸如一级结构等多方面的信息。近年来随着蛋白质数据库信息的快速增长和完善，PMF技术已成为蛋白质组研究中最常用、最快速、最有效的鉴定方法。蛋白质结构特殊，相对分子质量大，MS测定多肽和蛋白质序列是根据MS碎片离子推导的，序列信息碎片主要是通过酰胺键断裂形成。显而易见，分子质量的精准度是PMF的关键指标所在，但蛋白质的翻译后修饰可能会使其质量数与理论值不符，这就需要与序列信息适当结合。在PMF鉴定蛋白质中，目前最常用的方法是，采用2-DE技术将酶切得到的肽段进行分离，再利用MALDI-TOF—MS进行分析。品制备、PMF分析、数据库搜索这一过程已实现自动化，实现了蛋白质的快速鉴定。
      2．2 肽序列的测定肽序列测定方法是利用肽段裂解技术将肽段沿肽链断裂，形成长度仅相差一个氨基酸的一系列肽片段(肽段分子的离子)，对这些碎片离子系列综合分析，即可推断出肽段的氨基酸序列。较之传统的Edman降解末端测序技术，MS具有灵敏度高、速度快及不受末端封闭限制的特点。目前广泛使用的肽段裂解技术包括高能碰撞诱导解离(CID)和源后衰变(PSD)两种。用串联MS分析多肽序列时，复杂的肽混合物无需分离即可通过高能碰撞诱导解离直接测定肽段的氨基酸序列。原理为从一级MS产生的肽段中选择母离子，在第二级MS中，进一步与惰性气体碰撞形成N 端碎片离子系列(B系列)和C 端碎片离子系列(Y系列)。孙懿等利用串联MS鉴定了与鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集和失活相关的22个差异表达蛋白质，为阐明鼻咽癌病理机制提供了依据。Ehmann等利用MALDI—MS在血液中寻找与胰腺癌有关的生物标记物，并对其中最具代表性的3种标记物进行肽序列分析，其诊断敏感性可达100％，诊断特异性为98％，为胰腺癌的早期诊断提供了技术支持。但以上肽段裂解技术尚存在一些缺陷：在肽键断裂时对某低能量的肽键有偏好，如脯氨酸残基的氨基端和天冬氨酸残基的羧基端；且在串联MS图谱上，难以区分Ile和Leu以及Gln和Lys。故对于未知的肽段，目前MS测序技术还不可能取代Edman降解末端测序技术。但傅里叶变换离子回旋共振MS(FT—ICR-MS)特有的电子捕获解离(ECD)可解决这些问题，故其在肽序列标签的测定方面有广阔的应用前景。
      2．3 蛋白质翻译后修饰的确定和鉴别在很多情况下，蛋白质很容易发生天然或是人工的修饰。翻译后修饰(post—translational modifications)，如磷酸化、糖基化等，尤其是蛋白质磷酸化，在哺乳动物细胞中大约有1／3的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对许多生物化学功能起开／关调控作用。所以蛋白质结构鉴定的一个重要方面就是磷酸化修饰的鉴定，也是蛋白质结构研究的重要内容。在N 端封闭时，不能进行Edman降解，无法从序列信息获得蛋白的结构信息，如修饰的位点及修饰的程度等，就需要借助生物质谱技术的方法。因此，生物质谱已成为蛋白质磷酸化分析的首选工具。由于磷酸化肽段带负电荷，而MALDI—TOF—MS常用检测模式为正离子模式，其离子化效率低，大量非磷酸化肽段的信号抑制了磷酸化肽段的信号，且其PMF中缺少标志性离子，要尽可能把非磷酸化肽段的含量降到最小，因此，直接采用MALDI—TOF-MS检测磷酸化修饰位点比较困难。通常是采用MALDI—TOF-MS与碱性磷酸酶的去磷酸化作用相结合的方法来鉴定磷酸化肽段。由于肽上的一个磷酸基团(HPO3)丢失，分子质量数便减少80，通过分析磷酸酶作用前后肽谱的差异，即可确定磷酸化肽段及磷酸化位点的数目。MALDI—TOF还可通过源后衰变(PSD)进行翻译后修饰的分析研究。PSD是利用亚稳离子在飞行管中裂解时释放能量，使得反射飞行MS模式下离子反射能量聚集，亚稳离子飞行时间缩短，质荷比降低，导致MS谱图发生改变，从而检测出磷酸化位点。三重四极杆串联MS(TQ—MS)的前体离子扫描(precursor ion SCan)技术和中性丢失扫描(neutral loss scan)模式也是磷酸化修饰分析研究较常用的手段。
      2．4 蛋白质高级结构的测定对蛋白质高级结构的测定常采用近紫外圆二色谱法(CD)、荧光光谱法以及核磁共振技术，这些研究手段只能检测蛋白质溶液状态下的平均构象，而不能监测蛋白质的折叠过渡中间态。蛋白质构象中折叠的不同导致蛋白质分子中的氨其氢(H)与氘(D)放射性核素交换的速率和程度不同，H／D交换技术即是利用H／D交换速率和程度来推测蛋白质高级结构及非共价复合物的作用位点，是一种灵敏的探测蛋白质结构和动力学性质的方法。ESI—MS作为一个测量放射性核素变化的工具，能准确、灵敏、快速地检测H／D交换前后样品的质量变化，从而推测出可能的结构信息；且具有样品用量少、适合分析大分子蛋白质等特点，ESI—MS与H／D交换技术联用，已成为蛋白质三维结构研究中必不可少的分析手段。离子迁移谱(IMS)是一种气相环境下的电泳技术，它是根据被分析物的分子质量、电荷和碰撞截面(即大小和形状)来分离和辨别被分析物。目前将该技术与ESI、MALDI及MS技术联用于蛋白质和多肽分析研究，是蛋白质结构研究中最强有力的工具。利用IMS对多肽异构体混合物的构象研究结果表明，IMS具有分辨结构上仅存在微小差别的异构体的能力，这是普通的MS技术所不具备的。
      因此，ESI—IMS—MS联用技术在大分子结构及构象分析中具有非常突出的优势。与ESI相比，电喷雾解吸电离(DESI)是在常压下操作的，且离子源相对简单，使得DESI更易与IMS相匹配。Myung等将DESI与IMS-TOF联用于细胞色素C 和胞壁质酶蛋白的检测，结果显示，DESI与ESI所得到的MS谱图非常相似，且DESI离子化过程更温和，更易于得到蛋白质结构的准确信息。由此可见，将DESI与IMS联用具有更大的优势。

3 展望

      近年来随着科学技术的进步，质谱也得到了快速的发展，为蛋白质结构研究提供了强大的技术支持，被认为是生命科学研究的首选工具。将生物MS技术与蛋白质分离纯化技术及蛋白质化学修饰等技术相结合，可对蛋白质结构进行深入研究。相信随着生物MS技术的进步，蛋白质结构研究能向着分析速度更快、样品消耗更少、测定准确度更高、获得结构信息更多的方向发展，从而揭露蛋白质的结构，为揭示生命的本质提供了有力依据。

                                                                   编辑：范伟伟