分子诊断工具介绍及发展趋势

　　因分子技术具有内在准确性、敏感性、特异性和周转迅速的特点，带来了分子诊断行业的快速发展。此外，因为分子诊断技术具有准确性、敏感性和特异性，实验室人员能够从很小量的样本中就可获得有效的结果。这对法医检测领域来说是非常有用的，但同时该技术也可以检测到目标物质的极低浓度，从而使临床医生在极早期阶段就能检测到疾病。

　　产生的结果是，越来越多的公司致力于为特异性基因序列开发分子检测，并希望将他们出售给诊断实验室，但这些开发者可能不了解支持实验室从样本到结果所需要的完整工作流程的附加工具的需要。

　　本文展示了完成分子诊断检测和像PCR那样即将对分子诊断产生变革性影响潜能的一些工具所必须的技术类型。这么多年来，多数分子诊断实验室的核心技术都集中在检测DNA或RNA特异性、相对较短部分的方法上，其中这些检测方法能够对感染性疾病做出诊断，鉴定出对药物机制产生影响的特异性基因变体或检测出与癌症等疾病有关的基因。

　　该类似检测的核心部分是扩增技术，如实时定量多聚酶链反应（PCR）、转录调节扩增、靶向扩增和信号扩增。Sanger测序和DNA片段分析或采用毛细管电泳法的定量扩增等也是分子诊断实验室的核心技术，而且这些方法的程序中也包括一个扩增步骤。为了能利用DNA和RNA来诊断疾病的检测，分子诊断实验室必须运行可得出稳定、有效结果定义明确的工作流程，并拥有一些可使工作流程步骤合理化的特异性工具。基本的工作流程如下：

　　1. 样本采集和制备：从样本中提取出用于检测的基因材料；

　　2．扩增：基因材料被分离出来后，立即将其扩增到一个能被检测到的大小，从而进行诊断；

　　3．检测：一旦产生足够的靶向材料，光型传感器就能读取与检测的靶向材料有关的信号。信号必须是单一的或是多样的，以便在一次反应中检测出多种靶向物质（如多样检测）；

　　4．数据分析：对检测阶段产生的信号示值读数进行分析。将这些数值转换为实验室人员随时可解释的信息，从而最终为临床人员提供诊断结果。

　　样本制备包括样本提取在内的样本制备是所有分子检测中的第一个步骤。样本制备要分离出关心的核酸（DNA或RNA），并排除患者样本中所有干扰随后过程的潜在抑制因素。该过程还包括对核酸的浓缩，并提高检测到极低浓度目标的能力。

　　患者样本的类型很大程度上影响样本的制备方法。常见的分子实验室检测样本类型包括全血、血清、血浆、尿液、粪便、痰、棉签、新鲜冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。根据检测的患者样本类型不同，需要采用不同的样本制备方法在不破坏基因物质的情况下成功提取核酸。

　　对患者样本类型和核酸来源采用不同的提取试剂盒。例如，如果核酸来自于细菌而不是病毒，那应该采用不同的提取方法，原因是提取细菌DNA和提取病毒DNA的化学过程是不同的，而且可能获取最佳样本的步骤可能存在不同之处。样本提取试剂盒甚至可以是DNA和RNA特异性的试剂盒，从而提高某一特殊核酸类型的提取效率。

　　虽然还有一些分子诊断实验室仍然再使用人工样本制备方法，但大部分实验室采用的都是半自动化或全自动样本制备仪器。自动化通过消除与人工方法相关的操作者特异可变性帮助实验室获得更加一致的检测结果，而且还降低了人工操作的时间。这些特点可以获得更大的生产力并增加实验室输出量。

　　分子诊断实验室关注的一个重要领域是程序的流程化和高级质量控制（QC）的保证。正确的QC方法对保证准确的检测结果和传递有质量的患者护理是很重要的。仪器的质量控制是从有技术性的样本提取步骤开始的，确保提取过程正确运转。已存在的商业可得产品的作用是帮助实验室保证结果的可靠性。能说明这一点的例子有，模拟必须的患者样本所需步骤并遵循相同工作流程获得最准确检测结果的提取控制。

　　在定量检测中，当某一重要的结果是基因序列复制数量累加得到的时，用于校准检测的标准同样要因以下原因而通过提取是很关键的：提取通常会导致一些DNA或RNA的丢失。虽然这种丢失可能是很小的，但PCR的指数式扩增会使得提取中的少量丢失造成复制数量结果的明显改变。采用通过提取步骤的标准将会保证将因丢失而导致的样本丢失计算到结果中，那样患者的样本检测结果将会更加准确。

　　扩增和检测平台、检测

　　样本提取之后，伴随检测后的目标扩增是分子诊断工作流程中的下一个步骤。类似TMA的扩增方法是等温的且不需要温度周期变化。PCR需要多种加热和冷却循环来为分子复制提供核酸模板。这一步骤中需要的工具包括检测试剂和进行基因材料酶型扩增的仪器。

　　检测试剂可能含有包括核苷酸在内的一系列材料，酶扩增DNA所必须的引物，检测特异核酸序列的探针，为反应、缓冲液和更多物质提供能量的酶。

　　热循环周期扩增发生在热循环器中，而且根据技术的不同，可能会在扩增