白血病、淋巴瘤免疫分型标准操作规程
1.检验申请
白血病、淋巴瘤免疫分型
2.标本采集与处理
2．1 受检者准备：一般无需准备。
2.2 容器准备：抗凝试管。最好用含抗凝剂的真空采血管。
2.3 标本采集：骨髓液静脉1～2，如外周血白血病细胞较多，可抽静脉血2～3ml。淋巴瘤病人还可采用淋巴结活检组织一小颗。
2.4 抗凝剂：EDTA二钾或EDTA三钾。
2.5 标本的标记：粘贴检验单联号，最好粘贴条形码。
2.6 标本保存条件：当天完成测定或放置2～8℃冰箱内次日完成测定。
3．标本拒收的标准
3．1严重溶血的标本。
3．2已凝固的标本。
3．3室温放置超过1d的标本。
4、方法原理
白血病细胞本身未发现特殊的白血病抗原。免疫分型的原理是基于白血病细胞病变时分化阻滞学说。白血病细胞与正常髓系和淋巴祖细胞一样，会出现某个细胞发育阶段的抗原表达特征。由于细胞分化级系缺乏绝对的界限，所以免疫分型常采用一组级系相关的单抗来确定其相关抗原的存在。根据欧洲白血免疫学特征研究组和英国血液学标准化委员会方案的建议，如果骨髓和外周血中具有某些分化相关抗原的淋巴细胞超过20%，髓系抗原细胞超过20%可诊断某一类型的白血病。国内也有以淋巴、髓系抗原超过20%为标准，对某具有高度特异性的抗原如MPO、cyCD3 、CD79a等以10%作为判断标准。
5、试剂及其他用品准备
5.1常用免疫分型单克隆抗体：
5．1．1 T淋巴细胞白血病：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD25、CD71。
5．1．2 B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD21、CD22、CD23、CD24。
5．1．3 NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。
5．1．4 髓系白血病：CD13、CD14、cd15、CD33、CD64、CD68、MPO（髓过氧化物酶）。
5．1．5 红白血病：GlPA（血型糖蛋白A）、CD36、CD71。
5．1．6巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。
5．1．7干、祖细胞系：CD34、CD90、CD117、CD35。
5．1．8非系列特异性：CD9、CD38、CD45、HLA-DR
5．2为了方便测定，提高免疫分型的准确性，可采用多色标记的免疫单抗，常用以下系列的组合单抗。使用时可根据需要可选择。
5．2．1同型对照FITC/PE/CD45-ECD，
5．2．2 CD14-FITC/CD13-PE/CD45-ECD
5．2．3 CD15-FITC/CD33-PE/CD45-ECD
5．2．4 CD41-FITC/GPA-PE/CD45-ECD10ml
5．2．5 HLA-DR-FITC/CD34-PE/CD45-ECD
5．2．6 CD5-FITC/CD7-PE/CD3-ECD
5．2．7 CD20-FITC/CD10-PE/CD19-ECD
5．3 Q-Prep仪试剂1，试剂2，试剂3。
5．4磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4.
5.5 试剂盒来源：
5.6 试剂盒保存：2～8℃，避光保存。
5.7 试剂盒准备：根据说明书。
6． 适用仪器
适用Beckman-Counter品牌各个型号的流式细胞仪器。
7．操作
7．1免疫分型三色(2+1)方案
7．1．1对照管加10ml 同型对照FITC/PE/CD45-ECD。
7．1．2测定管各加10ml CD14-FITC/CD13-PE/CD45-ECD、10ml CD15-FITC/CD33-PE/CD45-ECD、10ml CD41-FITC/GPA-PE/CD45-ECD10ml 、HLA-DR-FITC/CD34-PE/CD45-ECD。
7．1．3测定管和对照管各加5～10′105全血、骨髓混匀，室温避光放置15min。
7．1．4 在Q-Prep仪上溶血，固定。
7．1．5 200rpm离心5min,弃上层后用PBS洗涤一次，弃上清。
7．1．6 加500μlPBS，在流式细胞仪上计数104个以上细胞，记录阳性百分率。
7．2免疫分型四色(3+1)方案
7．2．1对照管加10同型对照FITC/PE/CD45-ECD。
7．2．2测定管各加10ml CD5-FITC/CD7-PE/CD3-ECD、10ml CD20-FITC/CD10-PE/CD19-ECD，混匀，室温避光15min
7．2．3测定管和对照管各 加5 ml CD45-PC5和5-10′105全血、骨髓，室温避光放置15min
7．2．4在Q-Prep仪上溶血，固定。
7．2．5 200rpm离心5min,弃上层后用PBS洗涤一次，弃上清。
7．2．6 加500μlPBS，在流式细胞仪上计数104个以上细胞，记录阳性百分率。
7．3 注意事项： 骨髓或外周血细胞有核细胞数较少时，可先采用Ficol分离液分离有核细胞，用PBS洗涤有核细胞后，调整细胞浓度在5-10′105左右。
8．主要分析参数：
采用三色或四色分析方案。
9．白血病免疫分型的诊断标准
9．1 急性淋巴系白血病（ALL）
9．1．1急性B淋巴系白血病（B-ALL）
9．1．1．1MIC 标准:
B 祖细胞ALL
