噬菌体抗体库技术的研究进展
摘要：噬菌体抗体库技术是近10年来发展起来的一项新技术,可不经免疫制备抗体,又可实现完全人源化.该技术已经广泛应用于分子生物学和免疫学的研究.本文对这一项技术的研究方法、研究现状、存在的问题以及应用方面的进展等作了概括总结。
关键词：噬菌体 抗体库
中图分类号：R392 11?文献标识码：A
噬菌体抗体库技术是指用PCR扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体（ScFv）表达在噬菌体表面，经过“吸附-洗脱-扩增”过程筛选并富集特异性抗体[1]。该技术的建立是基因工程抗体研究领域的一次质的飞跃，是继多克隆抗体、单克隆抗体之后的第3代抗体，它为重组抗体的设计、筛选及生产方面的不断革新及改进提供了高效可靠的方法，极大地推动了重组抗体在科研、检测、临床诊断及治疗等方面的应用。自1989年美国Scripps研究所Lerner实验室首先应用噬菌体表面呈现技术构建成功抗体库以来，该技术在制备基因工程抗体方面取得了飞速发展，国内外已有很多人源或鼠源抗HIV、HBV、RSV、TNF、erbB2、gp120等噬菌体抗体的报道[2]。
噬菌体抗体库技术的发展主要依赖于以下3项技术的突破[3]：（1）PCR技术：用于扩增可变区基因的引物；（2）从大肠杆菌分泌有结合功能的Ig分子片段获得成功;(3) 噬菌体表面展示技术的建立。本文就该技术的研究方法、研究进展、现存问题、应用及展望做一概述。
1 研究方法
免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞（骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁挑体或经过免疫的小鼠脾脏等），其中以淋巴结的B淋巴细胞较好。建库的过程是：先提取细胞总RNA，进行RT-PCR扩增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，按一定比例将载体和轻链连接，转化感受态细菌并扩大培养，提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接，转化感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清液，加入PEG沉淀并收集噬菌体颗粒既得到噬菌体总抗体库。
库建成后可根据需要，采用某种特定抗原对总抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选，即可得到所需的特定次级抗体库，一般要进行3-5轮的筛选。常用的筛选方法有淘筛法、免疫亲和层析法、生物素选择法及特异性洗脱法即竞争筛选法等。
2 研究进展
2．1 载体
Winter小组构建了PEXmide3，其特点为：（1）应用点突变方法在4个克隆位点处引入Sfil/Ncol，Kpnl/Apal，Eagl/Motl，Nhel/Spel酶切位点这些位点在VL及VH中，出现频率很低，以确保VL及VH编码区在克隆入载体过程中不被切割。（2）在野生先导序列pelB（wt pelB）处引入Eagl/Motl酶切位点后，wt pelB第23位氨基酸由谷氨酰氨突变为丙氨酸，生成突变型pelB，这一改建提高了信号汰的穿膜效率。为了提高噬菌体的包装滴度，增加抗体库中每种克隆的拷贝数，Soderlind建立了质粒pGroE与PEXmide3共表达系统，使PEXmide3包装滴度增大了两个数量级，这一进展不仅提高了从大容量抗体库筛选稀有抗体克隆的几率，而且也为从cDNA文库，随机多肽文库、基因突变文库中筛选目的克隆提供了有力工具。Stratate gene公司也设计了一种新载体SurfZAP，它巧妙地将λ噬菌体包装转染的高效率与噬菌体呈现技术相结合，又有Phagemid序列，可将外源基因先插入SurfZAP包装后转染宿主菌，再借助辅助噬菌体将Phagemid切除，这样构建的抗体库要比电穿孔转化构建的大几倍。近年来Winter小组将组合感染与体内重组相结合，利用体内位点特异性重组系统将轻、重链基因重组表达噬菌体表面呈现系统，运用这一策略，大大提高了抗体库的库容。最近有学者使用了Cre-Loxp511体内重组系统，该系统中的Loxp511序列（ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT）是野生型Loxp（ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT）的突变型，位于轻、重链基因之间的Loxp511序列不仅是起到一个“Linker”的作用，而且在Cre重组酶作用下，不同pDNA5载体上的轻、重链基因在Loxp511位点发生链的替换，使库容量得到明显提高，而pDNA5因为引入Loxp511后，Loxp及Loxp511两序列共存于同一载体，既有利于不同载体间重组有效进行，又确保了同一载体上Scfv基因的构架稳定。
2．2 筛选
经典的筛选技术是将纯抗原包被在固相介质上，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或者低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。或者将抗原与生物素基因相连接，在将其固定在包被有streptavidind 的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。这些经典技术的前提条件是目标抗体所针对抗原的性质明确，能得到抗原纯品。对于抗原无法提纯或抗原性质不明确的情况，如癌细胞的表面受体等，则需要其他的筛选方法。最近Skerra等建立了双层膜筛选法，该方法避免了筛选可溶
