微流体PCR技术可准确地分析单细胞基因表达

微流体PCR技术可准确地分析单细胞基因表达

Fluidigm基于其专利的微流体技术开发了一种全新的单细胞基因表达检测方法，可以使你快速可靠地分离、处理、对单一细胞的基因组进行分析。仪器、芯片、试剂、软件、试剂盒整合的系统可以自动完成从细胞捕获、裂解、逆转录、预扩增，到最终检测和分析细胞活动的全部流程。

该平台的特点

达到更准确地检测单一细胞基因表达谱差异性

避免测量样品中所有细胞的平均值的坏处

鉴定以前不能分辨的细胞亚群和分解新的调控网络

在名义上均一的细胞群中，单一细胞在尺寸、蛋白质水平和mRNA表达转录上都存在差异，所以默认你的样品中每一个细胞都表现得完全一致是一种危险的赌博，测量集中到一起的多个细胞的平均值会掩盖细胞之间基因表达的显著差异。在看起来均一的细胞群中辨别细胞间的差异对于促进干细胞研究、理解癌细胞、鉴定免疫反应、研究生物治疗的有效性、发现退行性神经疾病的机理等方面都有至关重要的意义。

遗传学家和临床工作者一直在寻找一套完整的实验流程来检测分辨单一细胞，根据它们独特的基因组和转录组进行分群，同时将技术的噪音最小化。

目前研究单细胞基因表达的实验流程主要是利用显微抽取、流式细胞术、激光捕获显微切割等技术获得分离单细胞，随后进行单细胞裂解，抽提mRNA，将mRNA反转录为cDNA。再针对感兴趣的基因设计特异性引物，进行实时定量PCR，观察目的基因在不同的单细胞中的表达差异。该流程中不可避免的手工操作部份难度大，对操作者要求高，重现性差，已成为公认的阻碍单细胞研究的瓶颈。

Fluidigm的核心技术是微流体芯片（Integrated Fluidic Circuit, IFC）。这项技术是在1998年由加州理工学院的斯蒂芬?奎克（Stephen Quake）博士领导的研究小组发明的。当时他们试图寻找一种方法制造能控制极少量液体的微型装置，将其整合成为一个密集的管道系统，从而将成千上万相互独立的生物化学反应集中于一个很小的区域内。最终他们使用一种称为多层软光刻（Multilayer Soft Lithography）的生产过程，应用了一种橡胶类材料，制造出最早的微流体芯片（以下简称“IFC芯片”或“芯片”）(Unger et al. 113-16)，(Thorsen, Maerkl, and Quake 580-84)。经过进一步完善，目前这项技术已被Fluidigm成功地开发出了多种针对不同应用的生物芯片。包括用于单细胞捕获制备的芯片及用于单细胞基因表达的芯片等。

Fluidigm单细胞流程的技术平台由Fluidigm新推出的C1单细胞自动制备系统和已在单细胞基因表达分析中广泛被采用的BioMark? HD微流体PCR系统组成。C1单细胞自动制备系统可以同时捕获96个的细胞，在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程；接下来BioMarkHD系统使用96.96动态芯片，在几个小时内即可测试数以百计的单细胞中数百个基因的表达，而这些工作在传统的流程中通常要花几天的时间。

仪器、芯片、试剂盒、软件整合的系统，自动化的流程免除了繁重的加样和样品混合步骤，轻松做到“加样走人”。从而为研究细胞分化、测量单一细胞对特定刺激的反应、证实重要疾病生物标志物、验证RNA干扰沉默基因表达和实行候选药物筛选等开启了新的大门。

C1单细胞自动制备系统

1 小时内即可分离制备96个单细胞

BIOMARK? HD系统

30分钟内可进行9,216个 qPCR反应

整个流程可以让您轻松实现如下步骤：

捕获—组细胞只需一步加样即能迅速地分离到96个独立的反应仓完成制备

? 确认—质控节点确认捕获细胞数量及分辨活细胞和死细胞

? 裂解—快速直接的细胞裂解方法可节约时间和费用且不需要RNA纯化步骤

? 逆转录和预扩增—cDNA合成及特异目的片段扩增在一个样品中进行且不需要试剂混合及样品转移

? 收获—所有扩增产物被集中到一起、收集和转移到BioMark?  HD系统进行实时PCR分析

? 转移—在C1系统上预扩增的产物被稀释加样到动态芯片IFC上

? 定量PCR—将动态芯片IFC放到BioMark? HD系统上进行PCR反应和数据采集等

? 分析—用户友好界面的软件包可实时查看扩增曲线、获取彩色色热图及Ct数据等

C1单细胞自动制备系统结合BioMark? HD系统持续有效地优化了基因表达分析，支持多达96个单一细胞的96个转录子的分析。显著地提高了效率并进一步加速了单细胞基因表达谱的研究。