重新认识临床检验的基质（体）效应

                                                                                                                                                 冯仁丰

一、我开始意识到“基质效应”
      早于1985年，在生产控制血清中发现将纯肌酐配制于透析后的人血清（经透析后已不存在肌酐）内；为了解配制的可靠性取样检测，发现检测的肌酐量明显低于计算的预期量。经回收实验证实，认为肌酐的回收“有问题”。
      当时，Dr. Westgard的系列方法学评价中，有如何进行回收实验、并且以此计算方法的比例误差。但是，他没有解释：是什么原因造成这个回收问题。从那时起，我开始关注：为什么采用纯标准液为标准，检测具有血清为基体的样品，经常得不到回收100％的结果？
      在实践中我懂得了：要使血清样品的检测结果准确，应该将标准物质配制于血清中为标准，然后以实际反映的响应信号大小去估计样品内的肌酐含量，这样的结果才是可靠的。但是，是检测方法对检测的干扰、还是血清内的什么造成了结果的差异，当时还
不知道这就是“基质效应”。90年代的一次上海中美临床检验国际会议上，认识了Dr.Fred D. Lasky。他的演讲令我大开眼界，第
一次知道了matrix词语（当时他服务于强生公司）。
      1988年的奥运会足球冠亚军比赛，启发了我对纯标准液与病人血清间基质差异的认识。并在以后的写书和讲课中，解释了回收率和基质效应的关系。我将纯标准液与病人血清间的基质效应视为我对基质效应认识的第一阶段（第一层次的基质效应）。
      由于严重医疗事件，美国促使国会建立法规，对临床实验室实施行政管理。1988年美国国会通过临床实验室管理法规（CLIA’88），1992年正式实施。其中，要求所有被CLIA认可的实验室必须参加政府认可的实验室间质量评估计划（EQA），定期检查检测结果的准确度。在实践中，发现使用的调查样品难以反映实验室对新鲜病人标本检测的准确度。1992年6月，CAP的第23届年会上，专门讨论“基质效应”问题，并对如何合理开展EQA提出了现今在美国的做法，很值得我们深思。
      由于倪赞明主任的协助，认识了Dr. Robert F. Moran，在他的推荐下，Ciba Corning公司赞助我成为了NCCLS会员。以后，上海市临床检验中心开始有了系列的NCCLS文件。1999年，我看到了Dr. Fred Lasky写的这个基体效应评价的文件，使我对问题有了更深入的了解。
      EP14文件中叙述的基质效应，是专门关注于日常使用的控制品、校准品以及室间质量评估使用的调查品，它们与病人新鲜血清间的基质差异所致的“基质效应”，采用了比对的方法去显示该效应的存在和大小。非常强调要认真重视“处理过样品”的正确使用。我将存在于“处理过的样品”与新鲜病人血清间的基质效应看成为第二层次的效应，而且这个效应更为重要。
      现今检验同道似乎对基体效应并不陌生。可是要真正认识，并用于临床检验实践，还有很大距离。有没有认真思考以下一些问题：
      1、以往传统的临床化学检验，大多使用无蛋白血滤液，这是为什么？
      2、为什么今天都要求使用校准品校准，而不推荐使用纯物质配制的标准液？
      3、为什么校准品不能像标准液那样可以任意使用？必须在指定的检测系统上，某个校准品才能为该检测系统校准？
      4、既然控制品是采用人混合血清制备的，为什么控制品的结果不能说明检测系统的正确度，只能说明检测系统的精密度？
      5、为什么现有的检测系统，尤其是免疫项目产品，每换一个批号的试剂，检测结果就会有变化？有的厂商要求必须使用新的校准品定值？

二、第一层次的基质效应 -- 纯标准液与病人新鲜标本间的基质效应
1、基质使用的词语
      我使用过的中文词语有以下：Matrix：基体、基质、介质。Matrix effect：基体效应、基质效应、介质效应。
      我在1988年开始提出Matrix Effect的，使用的中文词语为“介质”。因为在上世纪50年代，检验界的老前辈写的酶活力检测的
方法中，将酶反应的底物（Substrate）引用了日本杂志上的“基质”。从我进入检验界看的资料、书刊、杂志上全部采用“基质”为酶反应的底物。因此，为了避免较老的同道在看到“基质”词语容易产生误解，我选用了“介基”词语。为此，前辈李健斋多次写稿、当面批评我用词不当，我只能“笑纳”而不改。但在李老师的不断批评下，我于2000年起采用了“基体”词语，哪知李老师还讲不通。后来我知道在编的技术统一词语中，接受了“基质”和“基体”两个词语均可使用，我才放心了。为了与大家已经习惯的使用保持一致，近几年我也开始使用“基质”描述“Matrix”了。
2、词语的定义
      1）基质（matrix）：基质亦称为“介质”或“基体”。在临床检测的分析环境中，除了分析物以外的所有其他物质和组分称为该分析物的基质。
      2）基质效应（matrix effect）：检测系统检测标本中的分析物时，处于分析物周围的所有非分析物质（基质）对分析物参与反应的影响，称为基质效应。
3、标准液和校准液
      在整个定量检验的历程中，一直使用标准液为所有患者标本检测确定检测结果的浓度或其他量值。但是，今天几乎都改成了使用校准液，为什么？国内还有实验室和厂商习惯使用纯分析物质配制于纯溶剂（如水）后形成的标准或参考液，以这样的标准液为准，求得各样品的分析结果。这样的做法忽视了病人样品和标准处于完全不同的基质状态。
      在标准液中，标准物单纯为分析物，当分析试剂与之反应时不会受到任何影响。但是样品中的分析物处于许多各种非分析物的环境中，分析试剂和标本混和后，处于分析物周围的非分析物对分析物参与反应会有强化或阻挠的影响，这是标准液所没有的。因此必然使样品测定结果引入误差，回收实验可以对这种影响的大小作出估计。
4、什么是回收实验
      回收（recovery）：分析方法对于样品中分析物的适当增量能实际检出的能力。用于该目的的实验为“回收实验”。它可以对分析方法使用纯标准液为标准，检测样品为病人样品时，检验结果受基质效应的影响作估计。回收实验可见图1。

      将每份患者血清标本等分为二。在一份血清中加入一定量的已知浓度的储存标准液A。另一份血清内加入相同量的储存标准配置的空白溶液。两份血清各自混匀。按照C1V1+C2V2=C3V3的稀释关系，可以计算出两个稀释后的血清标本内A分析物间的浓度差。将这两个标本使用分析方法进行检测，以标准液为准；实际检测结果差与计算的浓度差即为回收百分值。
5、对回收理解和克服基质效应方法
      1）回收率接近100％，说明分析方法对于分析物无论在纯溶液中还是在复杂的基质环境中，反应能力是一致的，即分析不受基质影响。若回收率明显偏离100％，说明分析方法对于分析物处于的基质环境不同，反应能力有明显差别，因此回收实验可以对分析方法受基质效应的影响作出估计。
      2）克服基质效应的方法是使测定标准和样品处于相同的基质环境，即标准亦应使用与被测样品相同基质的样品。测定的是血清，则标准也应是血清，以“抵销”基质效应的影响。尽管将纯的分析物配制于混合血清只是一种模拟方式，并不能适用于所有不同疾病的病人样品，但也是目前的唯一方式，这样的“标准”为校准品。
      3）基质效应并不就是干扰作用 （Interference），它包括了总的干扰作用。干扰和特异性（Specificity）评价中的一些非分析物的作用方式或原因是很清楚的，而基质效应只是对现象的分析和归纳的一种概括，尚无完整的解释。
6、从第一层次的基质效应想到的
      1）历史上，Folin-Wu等开创了临床化学检验的定量技术。无论是葡萄糖或肌酐等的检验，都毫无例外的必须对全血进行无蛋
白处理，当时这些前辈并不清楚“基质效应”。但是，为了克服蛋白等样品中的成分对葡萄糖或肌酐检测的影响，实践证明必须使用无蛋白血滤液。其实，这就是在检测中，先去除非分析物的“基质”，才能使检测结果可靠。
      2）今天，虽然碱性苦味酸的方法可以直接检测血清内的肌酐。但是，这些非肌酐基质的（主要是血清蛋白）存在，一定会影
响肌酐结果的可靠性。至今，血清肌酐检测参考方法还一定检测去蛋白的滤液。除了肌酐以外，应该清醒认识到任何项目，样品中相对于分析物的非分析物（基质）都会对检测结果有基值效应，只是影响大小而已。
      3）至少可以认识到，今后不应再使用纯物质配制的标准液校准检测系统。因为，纯标准液和病人标本间的基质差异。最好使用混合血清作为“标准”，校准检测系统。以这样的方式可以对大多结果“正常”的标本内非分析物的基质效应予以抵消。但是，危重病人标本的基质状态与“正常”标本的基质状态有着非常显著的差异。因此，相对而言，基质效应无法完全消除。
      4）标准液是采用纯物质配制的，内含分析物浓度是可以计算出来的。采用病人混合血清为“校准品”，其内含的分析物浓度
无法配制计算而得，必须倚靠检测系统的检测。因此，校准品的定值一定与检测它的检测系统关联。所以，校准品不是标准品，它对检测系统校准，故被称为“校准品”。新鲜混合血清至今是最佳校准品，可是，无法长期保存。
三、处理过样品与新鲜病人标本间的基质效应（第二层次基质效应）
1、控制品、校准品等引入的基质效应
      各种室间调查用的控制品（controls），亦包括室内控制用的控制品和校准品（calibrator），都经过加工处理，例如：冰冻、冷冻干燥、加稳定剂、添加某些分析物等，都是处理过的样品（processed sample）。它们都不是日常检验的新鲜病人样品。
      采用真实的病人血清作“标准”（校准品）校准检测系统，再由该检测系统去检测病人血清，以此克服标准液和真实血清间的基质效应。但是，该“标准”血清内也含有要检测的分析物，它的浓度为多少？需要采用检测系统先检测。不同的检测系统（方法学、检测程序）对该“标准”血清的检测结果不同。因此，校准品的定值一定与检测它的系统有关，即：校准品的值依赖于检测系统；也一定没有各个检测系统通用的校准品。
2、“处理过样品”（Processed Sample）的名称是因为：
      1）新鲜的原血清无法长期保存，必须对它进行防腐处理，或是加入防腐剂，或是冷冻干燥。
      2）冷冻干燥处理后使血清内部分内含脂蛋白变性，复溶液体变得浑浊；而且这样的浑浊随着冻干血清保存时间的延长越来越
严重，对使用带来困难。
      3）为了尽可能使复溶的冻干品变得清晰，目前大多厂商在制备中，先行去除a-脂蛋白，又经透析等处理。
      4）原有混合血清内各个分析物浓度不理想。对于过多的分析物采取透析或沉淀、吸附等处理；对不够的分析物则采用加入各种非人来源的原料，使其达到“理想”的水平。
      但是，这样处理后的原混合血清就与新鲜血清样品间产生了新的基质差异，也即当今关注的基质问题。
      任选一个厂商的校准品、控制品的说明书内，厂商指出添加物的示例有：酸性磷酸酶：人前列腺（重组）；ALT、AST、LD：
猪心；GGT：猪肾；白蛋白、胆固醇：牛血清；ALP：人胎盘（重组）；淀粉酶：猪胰；胆碱酯酶：人血清；肌酸激酶：兔肌；GLDH：牛肝；脂肪酶：人胰重组合；转铁蛋白：人Cohn Ⅳ组分；甘油三酯：鸡蛋黄：碳酸氢钠等。
      因为有了这么许多的非人的添加物，还要加入稳定剂等，再被加工为冻干制品。所有一切的加工处理，使得这样的校准品、控制品可以使用了，但是与来自人体的原始标本间又产生了新的基质差异。平时，检测新鲜病人样品时不常见的偏移（bias），在检测处理过样品时却常见，因为在处理过样品中有新鲜样品所没有的基质变化。这是新鲜样品与处理过样品间的基质差异产生新的基质效应。
3、第二层次的基质效应
      临床检验结果的准确度是检验可靠性的重要方面。为此，政府机构强调实施室间质量评估计划（proficiency testing or external quality assessment）作为评价各实验室正确度的依据。但是，现有数据说明，简单地从室间数据说明准确度不一定可行。
      下发的各种室间调查用的控制品（controls），都经过加工处理。例如，冷冻、冷冻干燥、加稳定剂、添加某些分析物等，都是处理过的样品（processed sample）。这亦包括室内控制用的控制品和校准品（calibrator）。它们都不是日常检验的病人新鲜标本（fresh specimen）。
      由于这些基质效应，以室间调查来评价检验正确度，若不注意会导致不正确结论，甚至会带来不应有的行政处理。基质效应涉及各个检验专业项目，表现有所不同。在分析中，仪器设计、试剂组成、方法原理、控制品、校准品、室间调查材料的组成和处理技术是产生基质效应的因素，它们间的互相作用又使基质效应变得更为复杂。
      对这类基质效应的观察，是了解某检测系统（包括方法学、仪器、试剂、操作程序等）在检测处理过的样品时，和病人新鲜样品结果间具有不同的偏倚大小。但是，只用一种检验方法检测处理过的样品和病人样品标本时，无法看出这种偏倚。
      EP-14A2文件的实验方法可以使实验室知道：使用的校准品、控制品、或室间调查样品等的“处理过样品”，在实际使用中，它们的表现是否与新鲜病人标本“一致”，即是否具有互换性。通过方法比较实验，假定某参考方法对病人新鲜样品和处理过的样品均能测出可靠结果，若被评价方法对新鲜病人样品的检测结果和参考方法比较具有的偏倚明显小于两方法对处理过样品对比具有的偏倚，即可说明该方法在检测处理过样品时具有的基质效应。显然，这样评价的基质效应是相对的。基质效应是对产生误差的解释，还不能阐明效应的真实机制。
四、基质效应示例
      为了让大家对基质效应有更多的理解，以下举出几个示例。
1、基质效应示例1 --正确度控制品（物质）
      上海市临床检验中心的临床化学实验室，前年11月，被IFCC任命为2012年度糖化血红蛋白（HbA1c）的网络实验室。去年再次被任命为2013年度糖化血红蛋白（HbA1c）的网络实验室。
      这是一个荣誉，但是也有很大的压力。实验室必须不断接受由IFCC的HbA1C专家实验室下发的样品，监视该实验室的检测水
平。这些调查样品是深低温保存的全血样品。如上所述，要求也必须收到后即刻检查：确保包装盒完整、盒内有干冰、样品未冻融等，然后立即置-70℃保存，在规定天数内完成检测上报结果。样品量很少，每个仅100μl。
      由于参考实验室使用的检测HbA1c方法已经被IFCC确认为IFCC参考方法，所以，只要对调查样品的检测结果符合IFCC的HbA1c的专家组认可。证实了：这个实验室现有的检测水平可以代表IFCC出示IFCC的值。
      这样的调查样品，使用的是新鲜的人全血，但经过深低温冰冻，可以长途运送。应该是“经冰冻过的样品”，也是一个处理过的样品，只是处理得“较轻”而已。
2、基质效应示例2 --校准品的定值以及它的计量溯源性
      校准品的定值过程中，为了实现计量上可追溯性，自始至终必需使用新鲜病人样品；始终采用方法学比较。为了使病人样品的结果和参考系统检测结果一致，去调整校准品的值。ISO 17511第7.3节：对准备由常规测量程序测量的某类型实际样品，应使用参考程序和经校准的常规程序同时测量，将结果作比较，以证实制造商产品校准品的互换性。即：校准品的定值不是参考实验室对校准品的直接测定结果，也不是常规检测系统的直接检测结果；而是在实现病人样品的结果和参考系统检测结果一致的要求下，校准品值被不断调整确定的（有关溯源性的内容，我将在以后再做介绍）！
      这里必须指出，所有校准品的定值都是专门为某个检测系统所有的。即不同的检测系统的校准品，对于相同分析物（项目）的校准值会不同。所有市售的校准品都只能为公司的检测系统服务，专用于该检测系统。只有这样的校准品才是真的。市场上有些公司的试剂盒也有校准品供应。须注意：任何校准品的专用性；如果提供者承诺任何仪器均可以使用的，如果只有一个校准值的，一定是问题。
3、基质效应示例 3 --肌酐的碱性苦味酸方法还要用吗？
1）经典的Jaffe反应
      Jaffe在1886年观察到在碱性条件下肌酐与苦味酸反应形成红色。该反应以他名字任命，已经经历了126年检测的年代。1904年，Folin应用Jaffe反应检测尿液的肌酐。可是，从Folin应用起，至今还没有弄清楚：究竟肌酐与碱性苦味酸是怎样反应的？即：肌酐的Jaffe反应只是一个现象的描述，不是什么反应原理！所以，肌酐的Jaffe反应没有检测原理。
      其实，从Folin开始，推出的Jaffe肌酐反应，使用了全血标本，经钨酸试剂去除蛋白后，以无蛋白血滤液参与反应的。但是，也因为如此的前处理，无蛋白血滤液去除了血液中的所有蛋白，再进行Jaffe反应时，肌酐受到如今那样的蛋白干扰大致上是没有的！今天的肌酐检测中，遇到的所谓“假性肌酐”的色素问题是自动化要求对肌酐直接检测引入的！
2）自动化分析要求建立不去除蛋白的直接Jaffe反应
      直接使用Jaffe反应对肌酐的检测，很快就认识到样品中的蛋白为主的非肌酐组分，对肌酐结果影响很大。开始研究Jaffe反应过程，确定肌酐与碱性苦味酸反应很快，干扰作用反应则慢得多。提出反应初期的Jaffe反应速率法检测肌酐，这应该是现今依然被广泛使用的分析仪上的肌酐Jaffe反应的检测方法基础。
      调整了Jaffe反应使用的试剂组分，使其不会对样品中蛋白产生沉淀，也保持了反应的线性范围。所有的检测方法全部为反应初期的速率法，大多采用了以血清为基础的校准品，都采用或宣称SRM914a为原始第一标准，对报告结果大多不做任何处理（即为非补偿Jaffe方法）。
3）肌酐检测酶法的推出，对临床实验室的肌酐检测是一个关键挑战。
      使用当今认可的核素稀释-质谱分析的参考方法，按照严格定值方案对多份新鲜病人样品赋予肌酐参考值；酶法通过这些血清的参考值，将可靠性传递给酶法专用的校准品。然后，酶法与ID-MS参考方法的直接比较，充分说明酶法是所有进入常规实验室的肌酐检测方法中最佳的。
      肌酐酶法在许多文献中，与各个Jaffe反应速率方法比较，都指出了现今的Jaffe反应速率方法非特异性的问题。由于所有现有的
Jaffe反应速率法，直接使用人血清，出现的非特异性问题大多是样品中蛋白所致的“非肌酐色素”问题。与最早的去除蛋白后，再
与碱性苦味酸反应具有的干扰不相似。因“非肌酐色素”使所有Jaffe反应的肌酐检测结果，明显高于酶法结果。
4）补偿Jaffe肌酐方法
      通过室间质量评估比对、病人样品肌酐检测结果比对，罗氏公司率先提出，对现有的Jaffe反应直接速率法进行“补偿”，使肌酐检测结果的数值与酶法肌酐结果相近。既然未补偿的Jaffe肌酐方法结果偏高的原因是样品内蛋白所致，假设一般样品内蛋白含量相似，它们的存在使肌酐结果偏高。因此，要使Jaffe肌酐方法结果与ID-MS参考方法或酶法相似，需要减去偏高的那部分，称为：补偿Jaffe方法。
      1994年美国六个实验室在今天的罗氏系统上，以肌酐Jaffe速率扣除空白速率方法与参考方法IDMS对六份血清进行比对。
      为了使Jaffe方法的实际相应值（y），得到相当于x的值，由回归关系：Y=0.793X+0.247（mg/dl），可以将校准品值设定作的处理为：设定点 =（原先设定点–截距）/斜率 ；即：
                                                            

      这样，可以使Jaffe直接速率法的结果，被回归关系调整为相当于ID-MS值。也即在自动化仪器上按上述的回归式首先将原Jaffe肌酐结果除斜率，然后再将该值减去0.3 mg/dl（27 mmol/L），成为补偿的最终结果。这样“形成”的一条新比对线，可以成为通过原点的、斜率为1的直线。
      要在所有Jaffe反应的血清结果上减去27μmol/L（0.3 mg/dl），这个数量反映了血清基质（如蛋白、葡萄糖、抗坏血酸、酮体等）参与Jaffe反应组分的基质效应平均贡献。这意即无肌酐血清参与Jaffe方法反应会得到平均0.3 mg/dl肌酐；这样一个“空白值”的存在，早期就有报告，但从来没有被正式应用。
     可是以后的文献说明，这样的做法依然在与核素稀释质谱分析的比对上，出现了斜率为0.963、截距为0.204 mg/dl的结果。

      比对中，尚有很多结果依然具有因蛋白所致的显著基质效应，产生了偏高的正偏移。尽管公司说明已经以NIST SRM 909b标准化（“重校准”），一个二级参考物质由IDMS对肌酐定值。但是，实现了溯源性的肌酐结果还是无法保证正确可靠。
5）肌酐结果正确度现状归纳
      自上世纪末以来，有关肌酐检测可靠性报告不断，对多个肌酐检测方法的比较很多。对广泛采用的直接Jaffe速率方法（未补偿）的结果可靠性，大众的评价均承认是问题，普遍结果偏高，不正确。但是，临床肾病专科对肌酐检测可靠性还很模糊。尤其国内，实验室已经改用了酶法检测肌酐，临床却认为为何病人的肌酐这么低！

      室间质量评估的结果似乎并没有显示肌酐的严重问题。关键是质量评估采用的调查样品均为“处理过的样品”，它们与新鲜的病人标本间具有明显的基质差异。调查后的结果处理，大多采用检测系统组分类（Peer Group）归纳，互相比较差异不大。国内调查的虚假行为太多，无法予以确认。国际上呼吁采用病人新鲜样品进行质量评估的呼声越来越高，而且不少这样的调查已经说明了问题。

      也许在国内的任何一个实验室，使用的肌酐检测试剂盒，还找不出认为没有溯源性的！这是大家的回答。自选试剂盒、任意搭配校准品，试剂厂商显示的报批文件证实说：我国的药监部门认可了他们的试剂盒具有溯源性、他们的校准品有溯源性。你承认吗？ISO 17511文件上在溯源性认识上早已指出：第4.3.1节：建立计量可追溯性应考虑到下列易出现的问题：
      a）人样品中分析物定义不充分。d）测量程序对给定校准品中的分析物有不同的特异性和选择性。注1：问题涉及给定校准等级中的系列测量程序，包括常规测量程序，以及用同一制造商产品校准品校准的一组两个或多个常规测量程序；此问题可使校准品的互通性无效。肌酐正是这样一个分析物，长期以来一直被认为肌酐结构简单，叙述溯源性很简单。可是，碱性苦味酸方法究竟检测的是怎样的肌酐尚未清楚的情况下，加上直接比色方法的基质状况复杂，自然使以为具有溯源性的肌酐检测结果依然没有实现互通性（互换性）。
      现在美国临床病例学会（CAP）向实验室提供了肌酐正确度评价血清，国内也有单位提供。这些血清采用世界公认的肌酐参考
方法，即：核素稀释质谱分析（ID-MS）方法，对多份血清进行定值。形成了当今在肌酐检测上正确度最高的血清。这些血清提供给一些厂商，让他们以这些定值为准，校准它们的校准品值。可是，以为这样实施的临床标本检测结果最可靠，哪知：当这个厂商与其他公司比对时，结果依然对不拢！原因何在？
      其实，所有问题归纳起来，关键是被检测的肌酐被测量定义不明确，即实验室报告的“肌酐”究竟是单纯的肌酐、还是肌酐
和内含其他非肌酐组分？又是哪些非肌酐组分与肌酐在一起被称为“肌酐”？这是严重问题！从最古老的Jaffe检测的“肌酐”起，它就不是检测真正的唯一“纯”肌酐。以后随着肌酐检测方法学的改进、变化，每个方法学检测肌酐的含义不一，这怎么能使表面的“肌酐”对得拢？可以认为，目前只有酶检测肌酐的方法可以使用这样的正确度血清予以评价。
      由于Jaffe试剂成本实在便宜，酶法试剂要贵得多，全球依然留恋廉价的Jaffe试剂，想尽办法予以保留，近期的所谓校准补偿的Jaffe速率（扣除空白速率）方法便是一个代表。酶法的分析性能已经被大众认可，对病人标本的检测结果可靠性基本被肯定。是成本第一，还是质量第一是当今的呼声。
4、基质效应示例4 --脂类和脂蛋白检测的基质效应
      1）2010年，美国对七个检测HDL和LDL胆固醇的直接方法与超离心参考检测程序的比较。结论：8个HDL-C中的6个、8个LDL-C中的5个符合国家胆固醇教育计划中的非疾病个体的总误差目标。但是，所有方法对疾病组的标本均不符合这些目标，因为缺少与不正常脂蛋白有关的特异性。
      2）2012年，美国国家胆固醇教育计划成年人治疗专家组Ⅳ（ATPⅣ）实验室专家组的信息。CAP ABL脂类和脂蛋白调查：
      CAP提供了以准确度为基础的脂类和脂蛋白调查（ABL），每年进行两次，每次发送3个样品，这些定期调查使实验室评估它们脂类和脂蛋白检测的准确度和一致性。CAP调查使用的样品是新鲜去除凝块后冰冻的6个供体的混合血清，每次调查含有不同的样品组，每个样品的浓度针对每个分析物临床上关联的浓度。每次调查检测总胆固醇、HDL-C、和LDL-C，参加者为140~190实验室，实验室结果按相同检测平台或试剂（方法学组）分组。

    图3 总胆固醇室间比对3个样品结果示例。第1个样品的总胆固醇靶值为6.2 mmol/L，第2个样
品的总胆固醇靶值为4.54 mmol/L，第3个样品总胆固醇靶值为4.6 mmol/L。图中每一条竖线为
一个检测系统的结果，线中黑方块为均值，线的长短表示组成这组检测系统所有调查值的分
布离散度。图中两条虚线为偏移加减3%的目标限。由图说明，总胆固醇的检测结果尚可。

    图4 HDL-C室间比对3个样品结果示例。第1个样品的HDL-C靶值为1.84 mmol/L，第2个样品
的HDL-C靶值为0.91 mmol/L，第3个样品HDL-C靶值为1.45 mmol/L。图中每一条竖线为一个
检测系统的结果，线中黑方块为均值，线的长短表示组成这组检测系统所有调查值的分布
离散度。图中两条虚线为偏移加减5%的目标限。由图说明，HDL-C的检测结果差于总胆固
醇，特别是第2个样品浓度在HDL-C临界偏低处，它的结果离散度最大。

    图5 LDL-C室间比对3个样品结果示例。第1个样品的LDL-C靶值为3.57 mmol/L，第2个样品
的LDL-C靶值为2.47 mmol/L，第3个样品LDL-C靶值为2.75 mmol/L。图中每一条竖线为一个
检测系统的结果，线中黑方块为均值，线的长短表示组成这组检测系统所有调查值的分布
离散度。图中两条虚线为偏移加减5%的目标限。由图说明，LDL-C的检测结果差于总胆固
醇和HDL-C，特别是第2个样品浓度的结果离散度最大。

    专家评述认为，CAP ABL调查提供的样品脂类检测信息，具有的特性非常相似于典型病人样品。但是，这个调查的多个局限性应受到关注。这些观察并没有反映各个病人新鲜样品实际状况，因为CAP ABL样品是冰冻的混合血清，会引入影响LDL-C检测的基质，它会混淆检测准确度的评估。样品的混合会稀释了各个病人样品具有的基质差异，可能使得某检测的性能看来好于它实际的表现。
      3）早于2000年出版的“脂蛋白检测手册（Handbook of Lipoprotein Testing）”中，第35章：
      脂类和脂蛋白检测标准化中的基质效应，作者W. Greg Miller详细地叙述和讨论了在脂类检测的基质效应。
      脂类和脂蛋白分析的近日常规方法依据酶学和免疫反应，因为纯的总胆固醇（TC）或甘油三酯（TG）分子仅溶于有机溶剂中，这些一级标准物质不适合对常规测定方法的校准。脂蛋白可以被纯化，但是，它们的三级和四级结构经常在纯化过程中会改变。这个结构的改变会影响它们在酶学和免疫反应的化学反应性。结果使制备的脂类检测的一级水溶性标准几乎对所有的检测系统均不实用。
      作为参考物质，最差的是市售可用的脂类控制品。这些物质用于过程监视，是非常稳定的组成。它们经常与许多常规方法具有显著的基质相互作用，必须依据新鲜血清进行相应的准确度确认与之结合。若有靶值，它们常依据最小的统计设计，并不包括可溯源至NRSCL的准确度。因此，质量控制物质的定值不可用于准确度的确认。
      评价PT结果现有实践，如果检测系统组均值一致，只是说明各个实验室应用的检测系统与其他用户的检测系统现状一样。检测系统组评价不可评价实验室在分析病人标本的准确度。
      所以，实验室也必须通过病人标本与认可的参考实验室比对，或应用具有文件证实可互换的参考物质，来确认准确度以及与NCEP导则的一致。
五、由试剂引入的第三层次基质效应
      上述的第一层次基质效应或第二层次基质效应讨论的，均为病人样品内的基质问题。没有涉及样品参与反应时，由试剂系统引入的基质效应。其实，引入基质效应的情况非常复杂，试剂在参与反应时也引入了基质效应。
1、试剂引入基质效应的原因
      试剂厂商在生产成批试剂时，尽管使用了现有最好的设备。但是，试剂需要讲究各个组分的准确含量。大规模生产采用的称量可以很精确，但是，要配制成精确量的容量设备缺失。唯一可行的是以称量替代容量。由于对配制量达到数千升时的称量，从容量上引入了很大的误差。这仅是成批试剂配制时引入的一个问题。
      其他诸如：各个试剂组分原料批间差异、调节pH的误差、离子强度差异、每批抗原来源和纯化差异、抗体来源和本身的免疫反应亲和力等差异、表面活性剂分子大小等的差异等，均会严重影响每批试剂的差异。
      配制中的搅拌速度、分装时间的长短、分装使用设备的清洗和灭菌问题、分装后的充惰性气体完整、冰冻干燥时各瓶试剂在冷冻箱内的位置等，也都会影响试剂质量。
      因此，试剂厂商提供的试剂批间一定有差异。只是在临床化学等产品上表现不明显；但是，对于免疫试剂，则批间差异表现很突出。
      免疫检测是在（试剂＋样品）混合环境下抗体和抗原的反应，该混合环境在每次检测中，对于每个样品或每批试剂都是不同的，即存在着基质差异导致的基质效应。通过更多地观察抗体和抗原间的免疫反应，就可以更好地理解经常使用“基质效应”的含义。
      基质在这里是反应混合物，由血清/血浆和试剂组成，由于诸如：pH、离子强度、脂肪含量、代谢产物（交叉反应素）、蛋白
含量、表面活性剂量等的影响，任何两个测定的基质都不一样。除了上述这些因素外，还会发生如：在产生信号时淬灭作用等与系统有关的基质效应。
      和抗原抗体结合有关的主要反应力是电荷力、氢键、范德华力、憎水作用，这个结合受各种物理和化学因素的影响。
      除了以上所述的反应中各种作用对反应的影响外，不同批号试剂内使用的抗原或抗体来源或组合都会有差异。当它们与同一
个人新鲜样品内的分析物反应时，各批试剂间的反应会有差异，这是样品参与反应的差异，即基质效应。
      同样，各批试剂对于“校准品”和“控制品”这些处理过的样品的反应更会有差异，它们与新鲜人血清间在参与反应中的差异，更是新鲜人血清与处理过样品间的明显基质效应。
2、确保人新鲜样品结果的可靠性
      为了确保同一个病人样品使用不同批号试剂得到的结果一致，惟一有效的方法是以具有参考值的人血清为依据，调整每批校准品对于每批试剂的校准值。这是为了克服客观存在的基质效应，才必须采取的措施－每批校准品对于不同批号的试剂具有不同校准值。
      为了真正保证每批试剂可以对同一样品得到一致的结果，一些公司在免疫产品中的标准化是一个非常有效的做法。基于免疫项目的广泛和参考物质或参考方法的缺乏，在为免疫项目检测系统校准中，与临床化学项目相比，不仅强调建立一级校准品（master
calibrator），而且也必须确立与之配合的一级试剂（master reagent）。
      依据国际上可接受的参考系统，对厂商提供检测组分的特定组合，例如：分析仪的类型、校准品、试剂批号等进行标准化。在实践中，对客户系统确定的各组分组合建立真实的校准关系，实现标准化。这样确保了厂商检测系统可以得到与选定的参考系统相同的结果。
      为了确保每批试剂对同一个病人样品的某项目分析物的检测，可得到相同的结果。通过标准化，对每批新试剂必须配合每批试剂专用的校准品的定值（即使是相同批号的校准品，对不同批号的试剂必须具有相应的校准值）。
      因此，相同批号的控制品，使用不同批号（相同厂商产品）的试剂一定会得到不同的检测结果。所以，按照质量控制要求，每换用试剂批号时，必须重新设定控制均值和标准差。
六、总结
      1、基质效应是当今临床实验室每天面临的现实问题，它越来越被临床实验室重视，应该予以充分理解和重视。
      2、一定不要忘记：任何项目（分析物，更正确的是被测量）被要求结果的可靠性，这个结果是新鲜病人标本的检测结果！不是任何控制品或室间调查品的结果。因为它们与新鲜病人样品间的明显基质差异。
      3、在可能的情况下，实验室应采用检测系统专用的校准品确保检测质量。
      4、没有通用于任何仪器、试剂、操作程序的校准品（即一个校准品，只有一个校准值；却可以用于任何组合的仪器、试剂上）。
      5、重视每天的质量控制，始终将病人结果可靠性放在实验室工作的第一位。
      6、因此，必须使用新鲜病人标本作为了解结果可靠性、一致性的根本。
      7、懂得和理解检测系统的概念和重要性，并在日常工作中坚持使用固定的检测系统对病人标本进行检测，必须使用与检测系
统配套的校准品。不要忘记校准品是“处理过的样品”，它的校准值只能用在固定的检测系统上！
      8、理解不同批号试剂，需要对同一批号的校准品给予不同校准值。因此在换用试剂批号时，必须同时更换校准品或校准值。
      9、控制品也是“处理过样品”。常用的控制品与新鲜病人标本间没有互换性。所以，每天的质量控制只是不精密度（即重
复性）的控制，没有正确度的控制。换用试剂批号时，也需要注意及时比对，调整控制品的均值。
      10、期望始终将临床的需求和病人利益放在我们临床实验室工作的第一位。

                                                                                                 摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第三期
                                                                                                                       编辑：范伟伟