ALT和AST参考方法的建立与性能评价

　   丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)是临床生化检验中检测次数最多的项目之一,也是常规体检的必检项目,对肝脏等疾病的诊断、病情和预后判断、疗效监测等具有重要意义。然而由于酶学检测对反应条件的依赖性,使得不同的检测方法间的结果可比性差。为了统一结果,临床酶学标准化经历了单位的统一、方法的统一直至近年来参考系统的提出,建立血清酶学参考测量系统是实现血清酶测定结果量值溯源和标准化的重要途径。参考测量系统包括参考测量程序(方法) 、参考物质和参考实验室。我们参照国际临床化学与检验医学联合会( IFCC)相关文件建立ALT和AST的参考方法 ,并对建立的参考方法进行性能确认,以期为临床酶学标准化研究打下基础。

材料和方法
一、材料
       1. 仪器　HITACHI  U-3310紫外可见分光光度计(带半导体温控和磁力搅拌) ;美国Fluke点式温度计; Eppendorf Research型移液器; JULABO ED-19型恒温水浴箱; Sartorius CP225D 十万分之一分析天平; Sartorius DOCU - 酸度计; Millipore Simp licity UA型超纯水机;各种高精度玻璃器皿。
       2. 试剂　三羟甲基氨基甲烷、L-丙氨酸、α-酮戊二酸、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐、吡哆醛-5磷酸、氯化钠、叠氮钠、丙酮酸、L-天门冬氨酸、氢氧化钠、草酰乙酸、盐酸均购自Sigma公司;乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、牛血清白蛋白等来源于Roche公司。实验用水为去离子水,电导率> 18兆欧。
       3. 样本　精密度实验样本来源于Roche公司正常值质控品( PNU,批号17898501) 、病理值质控品( PPU,批号17799501) 。准确度实验样本来源于IFCC组织的2007年度参考实验室外部质量评价计划(RELA)A、B样本以及日本临床化学会酶参考品( JC-ERM N和JC-ERM A) 。线性评价实验样本采用新鲜血清,无溶血、黄疸、脂血。
二、ALT和AST参考方法的建立与实验条件优化
       1. 仪器设备调试、校准及试剂配制　紫外分光光度计、分析天平、pH计、点温度计、移液器和容量瓶等由广东省质量技术监督部门检定和校准合格后方可使用。按照IFCC配方配制试剂。
       2. 反应参数　按照IFCC文件设定,反复试验熟练其操作步骤。
       3. 比色杯温控试验　将装有蒸馏水的比色杯放入分光光度计检测位,待温度稳定后使用点温度计监测温控器示温为36. 9～37. 4 ℃时比色杯内实际温度。每10 s读数1次,共监测200 s。
       4. 比色杯升温试验　根据比色杯温控实验结果将温控器调整至合适温度(比色杯内溶液实际温度最接近37 ℃) , 将装有蒸馏水( 37 ℃水浴20 min)的比色杯放入检测位, 10 s监测1次温度,绘制升温曲线,以了解其达到目标温度的时间。
       5. 移液器加样模式试验　探讨加样模式与加样精密度的关系,以200μL移液器吸取蒸馏水为例以称量法称量20次评价以下加样模式的精密度。模式1:吸一挡打两档; 模式2: 吸一挡打一档;模式3:吸两档打一档。各种模式又分靠壁和不靠壁。
       6. 移液器加样准确度试验　利用称量法对移液器100、200、250、500 和2 000 μL 量程进行准确度核实,每个量程称量7次,转换成20 ℃条件下体积与方法要求比较。
三、ALT和AST参考方法的主要性能评价
       1. 精密度验证实验　在室内质控在控条件下,参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)EP52A2文件,选择PNU和PPU 2个浓度水平的质控品,连续检测20 d, 每天2批、每批重复测定2次。对数据进行统计分析。
       2. 准确度验证实验　根据EP152A文件用参考方法检测以下物质,将结果与设定目标比较:(1)检测JC-ERM N和JC-ERM A,共检测5次,计算均值,比较其与靶值的相对偏倚是否在1 /4 美国临床实验室修正法规(CL IA′88)允许总误差(TEa) ( ±5% )内; (2)参加IFCC组织的2007年度RELA,每份样本检测5 d共40次,计算均值与所有实验室均值(“靶值”)比较,观察其相对偏倚是否在其等效限内( ±5. 25% ) 。
       3. 线性评价　参考EP62A文件 ,设定实验室的重复性和线性的允许误差范围分别为1%和5% ,选择覆盖IFCC文件提供线性范围20% ～30%的高(H) 、低(L)浓度水平混合血清,按比例配制成9个系列浓度样本,每个样本重复检测2次,将所得数据进行多项式回归统计。
四、统计学方法
       采用Microsoft Excel 2003及SPSS 13. 0软件系统对实验结果进行均值、标准差( s) 、变异系数(CV )以及回归等相关分析。

结　果
一、ALT和AST参考方法的建立与实验条件优化
       1. 仪器检定　U-3310紫外可见分光光度计、分析天平、pH计、点温度计、移液器和容量瓶均检定合格,不确定度在方法要求的范围内。
       2. 比色杯温控实验　在增加不搅拌条件下温控器显示为37. 1和37. 2 ℃时的温控实验,可见示温为37. 2 ℃时,比色杯内温度最接近37. 0 ℃。见表1。
       3. 比色杯升温试验　比色杯内溶液180 s后达到设定温度(37 ℃) ,见图1。

       4. 移液器加样模式实验　以200 μL 量程为例,结果见表2。精密度最佳的加样模式应为吸一挡打两档,打时靠壁。
       5. 移液器加样准确度实验　结果见表3。与允许偏差比较,各个核实量程均在方法要求范围内。

二、ALT和AST参考方法的主要性能评价
       1. 精密度　ALT、AST在2 个浓度的批内和总不精密度性能均小于设定目标,结果见表4。

       2. 准确度　ALT和AST参考方法检测酶参考品的相对偏倚均小于设定目标( 5% ) , 参加RELA的测定结果在等效限内,见表5。
       3. 线性评价　经计算得ALT和AST的重复性变异分别为0. 26%、0. 41% ,均未超过1%的设定允许误差范围,检测结果可用于线性评价。ALT多项式回归统计得到的二次多项式和三次多项式模型均有显著性的非线性系数,但三次多项式模型具有较小的回归标准误,因此最适方程为三次多项式。但非线性度评价有2个浓度超出设定非线性偏倚(5%) ,因此去除第9点重新统计,结果成线性,其检测范围上限为335. 8 U /L, IFCC报道为285. 8 U /L,见图2、图3。AST多项式回归统计结果得到二次多项式回归模型有显著性的系数,最适方程为二次多项式回归模型,计算其非线性偏倚,偏倚可接受,该组数据成线性, 其检测范围上限为363. 6 U /L, IFCC报道为247. 7 U /L。见图4。

讨　论
       本研究建立的是ALT和AST的一级参考方法,其结果直接溯源至SI单位kat上。因其具有最小的不确定度,故必须将各个产生误差环节加以控制,其中称量的准确度,玻璃容器、点温度计和酸度计的准确度,试剂纯度,比色杯内的温度以及加样精密度与准确度对结果的影响最为明显。因天平、玻璃仪器以及酸度计经计量检定合格,故控制人为误差即可;试剂采用国际知名品牌,其试剂纯度、影响物质等均能满足方法要求。需要注意的是,配制其规定pH值缓冲液时应在混合溶液中同时使用温度计和pH电极;然后在搅拌时滴定pH,达到其列表中要求的值。搅拌的速度应在校准、控制和调整时一样。pH电极应置于搅拌液的中央,注意在滴定中温度会改变。为此,在接近靶值时应再次控制温度,按照列表的pH值予以校正。对于pH 计上温度的补偿也应注意调整。由于反应体系的温度直接关系到酶活力浓度的高低,因此本研究专门对比色杯内溶液温度进行监测,结果表明温控器在搅拌时温控调整为37. 1及37. 2 ℃时比色杯内溶液温度最接近37 ℃度。考虑到监测时段无搅拌, 故温控示值为37. 2 ℃时最佳。移液器相关实验表明,吸一挡打两档,打时靠壁的加样模式具有最小的不精密度,其准确度实验也符合方法要求。当然,对于不同液体对其的影响有待于进一步研究。
       参考方法初步建立后,必须通过方法学性能评价实验来验证其是否符合要求。然而,作为参考方法应精密到何种程度,准确到何种程度,何种评价方案为佳,国际上尚无一致意见,但总的原则肯定是测量不确定度或误差明显小于常规方法。IFCC检验医学溯源委员会(C2TLM)为RELA 提出“等效限”的概念,其思路是根据常规方法的允许误差限制定参考方法分析质量指标(常规方法允许误差限的1 /2或1 /4) 。本研究就是按照其思路设定参考方法的性能要求。由结果可知2个酶参考方法的批内和总不精密度均小于设定目标,说明良好的操作一致性可以减小结果的CV。实验中加样需开盖操作不利于温度的恒定,尤其受室温影响较大,因此实验室空间应合适且温度能稳定控制,才能保证方法的精密度;另外加样手法是否一致对精密度影响较大,尤其擦拭吸头外壁应格外小心。
       在确认检测系统精密度符合要求的基础上,进行准确度验证实验。参考方法准确度验证最主要的方法就是使用有证酶参考品来确认。验证参考方法的准确度也正是酶参考品的主要作用。当然多个参考实验室比对实验的靶值也具有较高的准确度,因此本研究也参加了国际比对实验来验证其方法的准确度,结果显示与靶值的偏倚在规定等效限内。通过实验我们认为反应体系的温度、混匀程度以及加样的准确度对结果的准确性至关重要,应特别重视。本实验5%的允许误差严格意义上讲要求较低,而IFCC确认的酶参考品其不确定度约为2%左右。除了本实验采用验证方法外,还可参考NCCLS EP92A2文件与被认可参考实验室的参考方法进行新鲜人血清比对和偏倚评估,这样能将基质效应的影响降到最低;但因条件限制未在实验中采用。
       线性范围也是反映方法学性能评价的重要指标之一,能判断对某一分析方法测得的浓度或活性值与设定的浓度或活性值之间的比例关系的范围。结果显示ALT去除最高浓度点后成线性,而AST评价中考虑到低值浓度临床意义不大且只有1个浓度,因此认为其基本成线性。另外对于分析范围来说,低值浓度是由分析灵敏度中的检测低限决定的,因此本实验验证的是其分析测量上限。由结果可知,自建参考方法的检测范围上限均大于文献报道。
       综上所述,ALT和AST参考方法的主要分析性能符合质量目标要求。参考方法已基本建立,并具有优于常规方法的精密度及准确度等性能,即符合其不确定度小于常规方法的特性,可应用于后续临床研究。

                                                                                               编辑：范伟伟