原癌基因与抑癌基因

       近年来，原癌基因的研究是细胞生物学、分子生物学和肿瘤学的热点。
       最初，有关原癌基因的研究是从探索肿瘤的发生开始的，现已扩大到探索正常细胞的生长与分化、细胞信号转导、细胞周期调控以及其他多种疾病发生的关系。

原癌基因概述

一、原癌基因的发现
1 提出癌基因的存在
       1969 年， Vogt 和丰岛久真男提出鸡的Rous 肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）的基因组中存在一段与肿瘤发生有关的基因，称为致癌基因或癌基因（oncogene，Onc）。
2 最早分离的癌基因－src
       1976年，Stehelin（Bishop and Varmous 实验室），逆转录酶法
       a.用Rous肉瘤病毒为原材料，用逆转录酶法制出对应的DNA
       b.用不致癌病毒的RNA来结合，剩下一段DNA只能是癌基因
3 正常细胞中也有癌基因
       把src基因作为探针（probe），用southen法，发现从最低级到最高级动物的正常细胞中都有src
4 病毒和细胞中谁先有癌基因？
       高级生物细胞中src基因有一种“中间结构”的结构，病毒、细菌等低级生物中没有这种结构。
       src基因原本是细胞中的基因，是病毒盗取、俘获了细胞中的src基因。
       命名：a.病毒中Onc（viral oncogene，v-onc），已发现40多种，常以其产生的肿瘤名称或来源病毒名称,用v-加3个英文缩写字母，如v-src、v-ras（rat sarcoma virus）。
       b.细胞中Onc(cellular oncogene，c-onc),已发现60多种，常在c后加同源的v-onc名称。
5 人的癌基因分离
       “人癌基因大围猎”：相近时间、同一来源细胞、同一onc、均Nature发表。
6 癌基因的命名有问题－应更名为原癌基因
       正常细胞中存在的所谓癌基因其实只是真正意义癌基因的原形，应更名为原癌基因或前癌基因（proto-oncogene）。
       原癌基因从最简单的生物到人的正常细胞中都同样存在，说明它与生命最基本的活动有密切的关系，是生物体内极其重要的基因，是细胞内长期存在的保守序列，故也称管家基因（house keeer genes）。

肿瘤标志物的研究历史
第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原
       1963年Abelev发现了AFP，在肝癌、肠癌和生殖细胞肿瘤中AFP可以明显升高。
       1965年Gold & Freeman等人阐述了CEA与大肠癌密切相关，开辟了肿瘤标志物研究的时期。
第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主

       1980年Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）
       1981年Bast et al CA125（OC125）
第3阶段（1990以后）：基因标志、肿瘤基因标志

癌基因(oncogene，onc)及其表达产物的作用
       癌基因包括病毒癌基因（v-onc）和细胞癌基因（c-onc）两种，具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。V-onc是病毒基因组中特殊的核苷酸序列，能引起细胞转化；c-onc则存在于正常细胞基因组中的癌基因，在正常情况下处于静止状态或低表达状态，不仅对细胞无害，而且对维持细胞正常功能具有重要作用，但异常表达时，其产物可使细胞无限制分裂。
       癌基因的表示：用3个斜体小写字母表示，如ras、src、myc 等 。病毒癌基因在其名称前冠以前缀“v”，如v-ras。细胞癌基因：在其名称前冠以前缀“c”，如c-ras 。
（一）病毒癌基因
       病毒癌基因是在以Rous肉瘤病毒（Rous sarcoma virus，RSV）为代表的逆转录病毒中发现的。
       在正常情况下，病毒癌基因无活性，一旦受到辐射或化学致癌剂的影响，就会全部或部分活化，诱导肿瘤的发生。
（二）细胞癌基因
       在正常细胞中存在癌基因，被引入正常细胞时能使正常细胞转化为癌细胞。将细胞中的这种癌基因称为细胞癌基因（c-onc）或原癌基因（proto-onc）。
       细胞癌基因的作用：通过其表达产物蛋白质来体现的，通常根据编码来表达产物的功能。

二、细胞癌基因分类
1、sis 家族
       即c-sis ，定位在人类第22号染色体，有5个外显子，编码241个氨基酸的蛋白质（p28）。P28氨基酸顺序与人类PDGF氨基酸顺序有108位完全一致，它们都能与PDGF受体结合。PDGF能促进结缔组织及神经胶质细胞增殖。
       c-sis 特点：与人类的血小板衍生生长因子（PDGF）有87%的同源性，可与PDGF受体结合。c-sis 表达对细胞生长、分裂和分化具有重要调控作用。
2、erb 家族
       表达产物是细胞骨架蛋白，在细胞运动、分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及维持细胞形态方面具有重要作用。人的erb -B编码的是掐头的表皮生长因子受体，这种受体跨膜区域无变化，但受体两端变短，尤其是外侧被删除。这种受体可以和表皮生长因子长期结合，从而永久性的进行细胞信号传导，促进细胞增殖。
3、src 家族
       c-src 定位于第20号染色体，17个外显子。src 基因产物是蛋白激酶类，编码的蛋白质氨基酸序列有明显的相似性，都有一个250个氨基酸的同源结构区域，其表达产物均有酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase，TPK）活性。此类酶定位在细胞内测，通过激酶磷酸化作用，使其结构发生改变，增加激酶对底物的活性，激素生长信号在胞内的传递，与细胞无限生长关系密切。
4、ras 家族
       数量：H-ras 、K-ras 、N-ras
       H、K-ras 分别来自大鼠肉瘤病毒Harvey、Kirsten株，N-ras 从人的神经母细胞瘤（neuroblastoma）中获得。
       ras 家族4个外显子组成，编码蛋白质分子量21KD，编码的氨基酸顺序有85％的同源性，主要位于细胞膜的内侧面，属G蛋白。其作用是参与细胞增殖信号的细胞内转导过程，是维持细胞生长和分化的重要信号转换器。

5．myc 家族和myb 家族
       myc家族可分为c-myc,N-myc、L-myc、R-myc，编码3个外显子，1号外显子不编码，缺少ATG，但存在多个终止密码子；另外两个外显子表达62-64kDa或66-67kDa的蛋白，位于核内，属于DNA结合蛋白类，与DNA复制起动有关。

三、原癌基因的激活机制
       原癌基因具有正常的生理功能，被激活时又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。
       现已证实，射线辐射、化学致癌剂和病毒感染均可以导致原癌基因的激活。
（一）原癌基因点突变（point mutation）
       癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性。
（二）原癌基因获得外源启动子而激活
       肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示。在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多。
（三）原癌基因甲基化程度降低而激活
       DNA分子中的甲基化（methylation）对阻抑基因的转录具有重要作用。
       现已发现在结肠腺癌和小细胞肺癌的细胞中，ras基因的DNA甲基化水平比其邻近的正常细胞明显偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活。
（四）原癌基因的拷贝数增加
       基因扩增（amplification）是某些癌基因通过一些机制在原来的染色体上复制多个拷贝，超出了正常细胞的癌基因剂量，导致基因产物的增加，从而使细胞正常功能紊乱。例如：人视网膜母细胞瘤：N-myc扩增了10-200倍，相应的mRNA和蛋白质产物也都大量增加。
（五）基因易位或重排使原癌基因激活
       基因易位（translocation）
       基因重排（rearrangemant）
       有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生。
       染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生。

抑癌基因
       抑癌基因（suppresser gene）又称抗癌基因（anti-onc），是存在于正常细胞内的一类可抑制细胞生长的基因，并有潜在抑癌作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。

一、抑癌基因及其表达产物
       抑癌基因与调控细胞分裂和分化过程相关，可能与生长因子、某些蛋白激酶类活性密切相关，只是抑癌基因给予细胞的信号与原癌基因相反。

二、抑癌基因失活机理
1、视网膜母细胞瘤（retino-blastoma，Rb）
（1）特点
       基因组成：27个外显子，3-17外显于区域是基因重组和突变的热点。编码p105的蛋白质，其有结合DNA的活性，可受多种激酶系统催化而发生磷酸化。对于大量来自视网膜母细胞瘤的Rb基因序列进行分析，发现Rb基因完全或部分发生缺失；另一些Rb肿瘤中，基因完整，但序列分析显示有一个突变，它常发生于剪接点上，由于这一变异导致Rb mRNA组装时有外显于被漏掉，因而产生异常Rb蛋白质。

（2）p53基因
       17p13，11个外显子，10个内含子，编码393个氨基酸，p53是其产物。
       产物能结合DNA和被磷酸化。抑制肿瘤细胞停滞在修复前期不能进入S期复制DNA而促使细胞凋亡。

三．肿瘤发生中的基因变化
（一）肿瘤发生学说
       多种致癌因素综合作用的结果
       物理因素(如紫外线、电离辐射等)
       化学因素(如黄曲霉毒素)
       生物因素(DNA或RNA致癌病毒)
       经多次打击多阶段变化便形成了肿瘤。
1、启动阶段
       启动因子作用：细胞的DNA分子已发生改变，但表型仍显示正常。以极低剂量与细胞接触一次，即可启动细胞癌变过程，各种干细胞及处于增殖状态的细胞比静止状态的细胞对启动因子的作用更加敏感。
2、促癌阶段
       癌前细胞（表型正常而DNA已发生变化）在启动因子和促癌因子的协同作用下，细胞的表型发生变化，表现出癌细胞的表型。
3、转化阶段
       已恶变的细胞进入自主分裂增殖状态。促癌阶段形成的增生性病灶会进一步浸润、转移。
       实验证实肿瘤是由多步骤多阶段或多次打击而发生的疾病。人类结肠癌的发展是以下这些变化的积累，而不是它们之间发生的顺序。
（1）需要5-6个步骤
（2）ras的突变
（3）抑癌基因家族性多发性腺癌（FAP）、结肠癌缺失(DCC)的丢失
（4）c-myc基因的过度表达
（5） p53的缺失
（二）原癌基因的激活
1、ras基因的变异
2．myc基因的变异
（三）抑癌基因的失活
1、Rb基因的失活
2、p53基因的失活
3、其他
四、检测方法：
       1、PCR／ASO探针法（PCR-allele-specific oligonucleotide）该方法快速、灵敏度高，但点突变的检出仅限于突变探针的探测位点，不能检出探针邻近部位的点突变。
       2、限制性片段长度多态性（RFLP）分析

五、肿瘤相关基因检测的临床应用与评价
       只有极少数人肿瘤与其相关基因有密切特异性，如视网膜母细胞瘤与Rb基因、家族性结肠息肉与APC基因具有很高特异性，大多数肿瘤还不可能归纳出特异的基因改变。肿瘤的基因诊断尚不能作为第一诊断手段。
与肿瘤诊断有关的癌基因
· 在肿瘤中较普遍表达：c-myc、c-fos、H-ras、k-ras
· 在肿瘤中特异性表达：c-abl、c-sis
· 临床意义尚不明确：c-mos、cyes、cfps、c-sac等
白血病：abl、ras
多发性结肠息肉：c-myc
结肠癌，胰腺癌，肺癌：ras
乳腺癌，卵巢癌：BRCA1、c-erbB-2

                                                                                            摘自定向点金《临床实验室》杂志2013年第四期
                                                                                                                      编辑：范伟伟