临床微生物检验中快速药敏鉴定分析

一、快速药敏检测的研究背景和发展状况

抗生素耐药性是现代社会面临的全球性威胁。快速测定合适的抑制细菌生长的抗生素，可有效降低抗生素耐药性，提高临床治疗效果。传统的药敏试验方法依赖于光密度测量，需要长时间的培养。缓慢的药敏报告，限制了临床抗生素的合理应用，不合适的经验性治疗更加剧了多重耐药菌的泛滥。

鉴于质谱技术和核酸技术的发展，细菌鉴定快速化已经基本实现，甚至已经从天或者数小时缩减到1小时以内，因此研发新的快速抗生素敏感试验就更加急迫和有现实意义。

当前，在学术界及工业界有多种快速药敏检测的探索和尝试，大致可分为以下类型：1、检测在抗生素作用下微生物死亡的比例，常见方法有流式细胞仪检测，特异性染色等；2、通过对代谢底物或代谢产物检测，表征微生物生长状况，报告药敏试验结果；如Patrice Nordmann等，以pH显色传感器检测葡萄糖代谢产酸建立快速药敏检测系统可实现2小时内检测肠杆菌对多粘菌素的耐药性^[1]，类似的，还有重水培养-拉曼光谱检测的快速药敏系统；荧光培养底物积累检测的快速药敏系统等；3、通过相差显微镜/荧光显微镜观察抗生素作用下微生物生长情况，如在Kelly Flentie等人建立的快速药敏检测系统中，通过对微生物表面进行荧光标记—96孔板微孔板读孔装置检测，可实现5小时内取得药敏结果^[2]；有研究显示，通过显微镜可直接观察微流控芯片捕获富集尿样本中的微生物生长速率差异，实现更短（30分钟内）报告药敏结果，等等。还有非常多的将新技术用于这个领域以求实现更快报告药敏结果的尝试，如激光散射技术，纳米电化学传感器，共振压电介质等等^[3]。

可喜的是，近年来，关于快速药敏的研发受到极大关注，研发方案和思路层出不穷，但是这些方案，哪怕是已经实现临床应用的商业化产品，仍然存在诸多问题，比如使用范围窄、成本过高、操作繁琐、结果不够准确等；迄今为止，在临床应用中还没有出现临床接受度高，能够很好地取代传统药敏试验的快速药敏方案。鑫科生物也在快速药敏检测方面做了大量的研发创新工作，现在一种更加贴近于传统药敏，具有更加快速的检测速度的新型药敏分析仪已经进入临床测试阶段，初步的数据显示了良好的应用前景。

二、个体细胞计数快速药敏分析方法及初步研究结果

1. XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪检测原理：鑫科生物自主研发的细胞个体计数快速药敏分析仪，通过微观视角，观察单个微生物细胞在抗生素作用下的生长、繁殖、代谢的情况，来反映微生物和抗生素之间的耐受关系，是一种创新的方法学，并且具有快速准确的特点。 

预制48孔全定量药敏板，采用标准肉汤稀释法接种待测菌液，放入分析仪，仪器孵育2小时后，探针自动吸取菌液，通过电阻抗细胞计数法进行细胞个体计数及形态分析，生成脉冲信号（图1）；设备对脉冲信号进行计算得出细胞数量，软件通过数据库比对和智能模型分析报告MIC数值（图2）。

注：1. 一定浓度的待测菌液加入药敏测试板；2. 孵育一定时间，采用个体细胞计数法检测细胞数量

图1. 个体细胞计数药敏检测原理

注：使用个体细胞计数法，在菌株接种药敏板孵育2小时后检测标准菌株ATCC25922对庆大霉素的MIC

值是0.25，和肉汤稀释法MIC质控范围是0.25-1一致

图2. ATCC25922 vs. Gentamicin的MIC检测

2. 研究结果：（1）革兰阴性杆菌2h质控评价：参考CLSI微量肉汤稀释法,使用个体细胞计数法对革兰阴性标准菌株ATCC25955、ATCC700323、ATCC27853进行了2小时孵育，获得质控MIC进行评价(图3,4,5)。结果显示ATCC25955、ATCC700323对氨曲南、美罗培南、头孢他啶等12个测试的抗生素质控全部通过；ATCC27853对氨曲南的质控范围要求为2-8，使用个体细胞计数法的检测值是2，参考肉汤稀释法的测量值是8，符合CLSI的质控要求。 

图3. ATCC25922的质控评价

图4. ATCC700323的质控评价

图5. ATCC27853的质控评价

（2）革兰阴性临床菌株药敏测试性能评价：在聊城市人民医院，收集了临床21株大肠埃希氏菌和11株肺炎克雷伯菌，使用个体细胞计数药敏分析仪对头孢他啶、亚胺培南、美罗培南等13种抗生素进行了2小时的MIC检测，药敏结果的评价依据CLSI M52，准确性EA/CA≥90%；VME/ME＜3%。测试结果见表1。

表1. 21株大肠埃希菌+11株肺炎克雷伯菌2h AST评价

从质控菌株和临床菌株的性能数据可见，32株肠杆菌对头孢他啶、亚胺培南、美罗培南和复方新诺明的EA低于90%，对氨曲南和亚胺培南的CA低于90%；对头孢他啶、氨曲南、亚胺培南、美罗培南的VME超过3%，需要进一步的验证和对算法的改进。

总体来说个体细胞计数药敏方法与肉汤稀释法相比具有很好的一致性，同时此方法基于经典的药敏解释标准，对临床占比较大的肠道杆菌具有很好的应用前景。

三、个体细胞计数快速药敏的应用前景

XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪以微量肉汤稀释法为基础，遵循当前常用的药敏解释标准EUCAST和CLSI标准，对临床使用习惯兼容性高；联合MALDI-TOF MS使用可以实现2小时内完成快速鉴定+药敏临床报告，在血标本和尿标本的药敏检测方面具有更好的应用前景。

四、快速药敏检测对单纯性尿路感染病人用药的改善

尿路感染的诊断和处理通常需要48小时后才能获得抗生素敏感性试验（AST）的结果。由于检测结果不及时，临床治疗多采用经验用药。广谱抗生素的使用，增加了新的感染风险；若选择了无效的抗生素，导致感染恶化，造成患者的痛苦和更多医疗费用。因此，缩短AST结果的时间是提高诊疗效果的一个重要因素，尤其是多重耐药菌导致的尿路感染。

对于多数单纯性尿路感染的病人，尿液直接培养时间为18小时,采用XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪，可在2小时内得到精确药敏试验结果，因此可实现20小时内发出尿液药敏报告。更快的精准UTI ID/AST可以让临床医生更快地让患者接受正确的靶向治疗，从而改善患者的预后和抗菌药物敏感性。

五、细胞个体计数快速药敏在血培养阳性标本中的应用

研究显示，血流感染患者，发生休克后，有效抗生素的使用每延迟1小时，患者存活率下降7.6%，死亡率显著上升^[4]。对于严重血流感染，抗生素测试结果的时效性以分钟计量，尽快得到药敏报告，从经验性治疗转为精准治疗尤为重要。根据数据统计，接近80%血培养阳性结果出现在24小时以内^[5]，如果进行常规的药敏，需进行划线转种，平均生长时间18小时，再8-24小时才能得到结果，总体时间为50-66小时；而应用个体细胞计数药敏分析仪，可以进行直接或者常规培养后的药敏检测，药敏测试时间只需2小时，总体时间缩短至26-44小时。而对于血培养中占比高达52%的肠杆菌，其平均报阳时间才16小时^[6]，应用个体细胞计数快速药敏分析仪对重症科室占比较大的肠道杆菌如肺克、大肠进行快速药敏分析，使TAT时间减到18-36小时，有助于早期从经验用药转变为精准用药，提高抗生素使用的准确性。

XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪及配套试剂的开发得到了国内外专家的大力支持。目前，XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪第一代产品预计今年3月份可取得器械注册证，肠杆菌药敏试验配套板卡即将在北京协和医院和上海瑞金医院开展临床试验，预计今年年底前可以问世。

XK FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪将大幅缩短临床药敏报告时间，有效提高我国感染性疾病诊疗水平，为合理使用抗生素，加强抗生素管控，遏制抗生素耐药做出贡献。

山东鑫科生物科技股份有限公司 张会翠   崔璟   周亚丹

参考文献

1. Smith, K. P., Richmond, D. L., Brennan-Krohn, T., Elliott, H. L. & Kirby, J. E. Development of MAST: a microscopy-based antimicrobial susceptibility testing platform. SLAS Technol. 22, 662-674 (2017).

2. Nordmann, P., Jayol, A. & Poirel, L. Rapid detection of polymyxin resistance in Enterobacteriaceae. Emerg. Infect. Dis. 22, 1038-1043 (2016).

3. van Belkum, A., Burnham, CA.D., Rossen, J.W.A. et al. Innovative and rapid antimicrobial susceptibility testing systems. Nat Rev Microbiol 18, 299-311 (2020).

4. Adapted from Kumar A, et al. Crit Care Med. 2006; 34(6): 1589-96.

5. 李杰芬, 储从家, 李雪梅等.血培养阳性仪器报警时间分析. 实验与检验医学2020年8月第38卷第4期.

6. 张嫘, 董爱英, 黄军祉等. 血培养报阳时间对临床病原菌的预测价值及临床意义. 华北理工大学学报 (医学版), 2019年11月第21卷第6期.