血清γ-谷氨酰基转移酶的测量不确定度评定

    倪红兵 王惠民 （江苏南通大学附属医院检验医学中心　南通226001）

      倪红兵，1972年生，男，主管技师，硕士，从事临床生化检验工作。
      王惠民，电子信箱：ntfyjyk@pub.nt.jsinfo.net
      王惠民，南通大学附属医院检验科主任，主任技师，江苏省有突出贡献的中青年专家。现任中华医院管理学会临床实验管理委员会委员。卫生部专业资格考试专家委员会委员、中华医学检验学会分子生物学组专家委员、《中华医学实践杂志》编委会委员、江苏医学会临床检验专科学会副主任委员、《临床检验杂志》编委会常务编委、江苏省中西结合实验医学专业委员会副主任委员、中国实验室国家认可委员会评审员。致力于分子生物学、临床酶学以及实验室管理，成果可鉴。先后出访新加波、美国和日本进行学术交流。近五年来承担或参加科研项目有国家863课题2项、国家自然科学基金项目1项、省级3项、市级多项。先后获省科技进步三等奖2项、市厅级科技进步一等奖一项、二等奖四项；主编专著1部，参编专著4部；获国家发明专利1项；发表学术论文二十多篇。

【摘要】目的：探讨临床实验室对测量不确定度的评定方法和程序。方法：应用国际临床化学联合会（IFCC）公布的参考方法对参考实验室外部质量评价计划（RELA）样本进行γ-谷氨酰基转移酶（GGT）催化活性浓度测定，明确反映整个过程测量不确定度分量
的来源，按A、B两类不确定度的计算方式对各分量分别进行评定，计算相对合成标准不确定度，最后取95％置信区间，计算出扩展不确定度。结果：GGT催化活性浓度均值为3.492μkat/L，相对合成标准不确定度ucrel：0.95％，取95％置信区间，包含因子k=2，则扩展不确定度（U）：0.019。结论：临床实验室的测量不确定度与传统的测量误差相比，更能反映测量的水平，对临床检验工作有一定的指导意义。
【关键词】测量不确定度；γ-谷氨酰基转移酶；合成标准不确定度；扩展不确定度

      测量不确定度是指表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数。于1963年由美国标准局的Eisenhart首先提出，随着1993年《测量不确定度表示指南》（GUM）的公布[1]，对不确定度的评定与表示方法作出了明确规定，使得国际范围内统计结果的比较有了统一的方法，同时也标志着测量不确定度用于解决计量问题获得了国际认同，并在各国开始应用。近年来临床实验室认可活动越来越普遍，ISO/IEC 17025和ISO 15189都对实验室的不确定度评定提出了相应的要求[2-3]。另外，在建立参考体系的实验室，必须按ISO 15193、15194和15195规范参考测量方法的应用、参考物质和参考实验室的管理，在这些活动过程中，都应用测量不确定度及必须对测量不确定度进行评定。本室运行国际临床化学联合会（IFCC）酶学测定参考方法并参加了2008年度的IFCC参考实验室室间质评（RELA）活动，现以γ-谷氨酰基转移酶（GGT）活性测定为例，具体分析测量不确定度评定的过程。
材料与方法
一、材料
      1．仪器：用于比色测定的日立U-3310紫外/可见分光光度计，配有半导体控温、磁力搅拌及点温计装置和反应动力学分析软件，计算单位时间内的吸光度变化；美国Fluke公司HART SCIENTIFIC 1521型电子温度计（精度0.001℃）用于反应及试剂配制过程中温度的监控；意大利HANNA公司HI 98183型pH计（精度0.002）用于反应溶液pH的测量；德国Sartorius BT25S电子天平（精度0.01mg）用于试剂配制、样本复溶时的称量和移液器及容量瓶的内校；反应液的吸取和样本加入采用德国Eppendorf reference移液器。分光光度计、天平、pH计、温度计和移液器每年由市计量局进行1次检定，分光光度计每天使用前进行自检，天平、pH计每次使用前进行自校。
      2．试剂：（1）试剂原料：实验所用原料购自Sigma公司，纯度为分析纯。实验用水为去离子水：pH值6-7，电导率<2μs/cm，硅酸盐<0.1mg/L。（2）试剂配制：试剂配制严格按照IFCC公布的酶学测定参考方法（37℃）的标准操作程序（SOP）。
      3．样本：国际比对样本由IFCC提供（A、B两个浓度水平），冻干粉末避光保存于4℃。临用前按规定程序进行复溶。
二、方法（测量不确定度评定的过程及结果报告）
1．被测量的技术规定
      应用IFCC参考方法、自配试剂在分光光度计上对血清GGT催化活性浓度进行测定。（1）测定原理：L-γ-谷酰基-3-羧基-4-硝基苯胺＋甘氨酰甘氨酸5-氨基-2-硝基苯甲酸酯＋L-γ-谷酰基-甘氨酰甘氨酸。（2）测定条件：温度37.0℃±0.1℃（扩展不确定度k=2）；波长410nm±1nm；波宽≤2nm；光路10mm±0.01mm；孵育时间180秒；延迟时间60秒；测量间隔180秒；读数（测定点）≥6。（3）测定流程：分析前：仪器校准与准备、试剂配制、样本复溶；分析中：紫外分光光度计自检、室内质量控制、样本测定；分析后：结果报告。（4）被测量（GGT）的计算公式：公式1中CGGT：GGT酶催化活性浓度（U/L）；ΔA/ΔT：反应速率（A/min）；ε：摩尔吸光系数（m2/mol）；VR1、VR2、VS分别为试剂1、2和样本体积（μl）；L：比色杯光径（mm）。
2．识别不确定度来源
      根据第1步中测定流程、测定条件及计算公式，明确不确定度的来源。酶活性测定不确定度来源也即影响酶反应的因素主要有：底物种类和浓度、缓冲液种类、离子强度和最适pH、反应温度、抑制剂、样品与试剂比例等。由于本实验依据IFCC推荐的GGT参考方法，实验采用手工操作进行测定，因此其不确定度来源除上述因素外，还有在自配试剂及样品复溶时天平称量的准确性、测定时所加试剂与样品体积的准确性以及其他仪器的影响等等。缜密考虑影响GGT测定的所有因素，将其绘制成因果关系图（或称鱼骨图），其标明了不确定度的有关来源，见图1。

    图一 血清GGT活性测定因果关系图

3．量化不确定度
      按第2步的说明识别不确定度来源后，接着就量化这些不确定度来源所产生的不确定度。测量不确定度一般包括很多分量，其中一些分量是由连续测量结果经统计学处理而得出，如标准差，这类通过对观测列进行统计分析的方法来评定标准不确定度的称为A类评定；而另一些分量是根据经验或其它信息而确定，如从某些证书上得到的数据计算出的不确定度，也即用不同于对观测列进行统计分析的方法来评定标准不确定度的称为B类评定。另外，不是所有的分量都会对合成不确定度构成显著的贡献，实际上只有很少的分量才会有显著影响。根据CNAS-GL06的要求，如对总体不确定度影响很小的分量，如比最大的分量小1/3的分量，可以忽略。同时鉴于本实验的性质，将所有影响因素进行综合分析，去除对总不确定影响很小的分量及不易确定的分量，挑选出对总不确定度影响较大的分量进行计算。本实验中最终不确定度的主要分量确定以下五项：复溶（校准因素）、测量（重复因素）、光径（校准因素）、温度（校准因素）、体积（校准因素）。其中，重复因素引起A类不确定度；校准因素引起B类不确定度。图2为经简化后的GGT活性测定因果关系图。

    图2 血清GGT活性测定简化因果关系图

4．计算合成不确定度
      合成前，所有不确定度分量必须以标准不确定度即标准偏差表示，用公式2计算出合成标准不确定度。最后一步是将合成标准不确定度和所选的包含因子相乘得到扩展不确定度，见公式3。

      公式2、3中： ：合成标准不确定度；u(xi)：各不确定度分量的标准不确定度； ：扩展不确定度；k：包含因子；k=2表示置信水平为95%。
4.1 标准不确定度
      4.1.1 复溶（即天平称量，校准因素）过程引入的不确定度本实验GGT样本的复溶主要用天平进行称量。市计量局对本室天平检定U为0.05mg。根据经验可认为是极限值，符合矩形分布，标准不确定度的计算为U/ 。复溶的标准不确定度u复溶=U/ =0.05/ =2.89×10-2mg，相对标准不确定度urel复溶=u复溶/5g=2.89×10-2mg/5g=5.78×10-6。
      4.1.2 比色杯光径（校准因素）引入的不确定度本实验使用日立U-3310分光光度计及配套的比色杯，校准证书上标注的光径值的不确定度为0.05mm，根据经验假定为三角形分布，标准不确定度的计算为U/ 。因此比色杯光径的标准不确定度u光径=U/ =0.05/ =2.0×10-2mm，相对标准不确定度urel光径=u光径/10mm=2.0×10-2/10=2.0×10-3。
      4.1.3 移液器加样体积（校准因素）引入的不确定度本实验共分三步加样：R1、样本、R2，计算由每步加样移液器固有因素引起的相对标准不确定度。根据市计量局出具的校准数据，VR1、VR2和VS的不确定度分别为10、3、4μl，根据经验可按三角形分布计算标准不确定度，计算公式为U/ 。VR1、VR2和VS的吸样量分别为2.0ml、0.50ml、0.25ml，以此计算相对不确定度。VR1标准不确定度uVR1=U/ =10/=4.0μl，相对标准不确定度urel.VR1=4.0μl/2.0ml=2.0×10-3。V R2标准不确定度uVR2=U/ =3/ =1.22μl，相对标准不确定度urel.VR2=1.22μl/0.50ml=2.44×10-3。VS标准不确定度u VS=U/ =4 / =1.63μ l ， 相对标准不确定度urel .VS=1.63μl/0.25ml=6.52×10-3。
      4.1.4 测定温度（校准因素）引入的不确定度表示由温度校准因素即点温计固有因素引起的相对标准不确定度。本实验使用的温度计据市计量局出具的校准结果U为0.01℃，根据实际工作中的观察，反应过程中温度可在0.1℃内波动，因此总的不确定度应为0.11℃，假定该值为矩形分布。另考虑到温度升高10℃，反应速率增高1倍，如升高1℃酶活性浓度可增高10%。其标准不确定度u温度=U/ ×10%=0.11/×10%=6.35×10-3。因温度升高10℃时酶活性才引起变化，假设0.11℃为酶反应总温度的1%，因此其相对标准不确定度urel温度=u 温度/100=6.35×10-5。
      4.1.5 样本测量（重复因素）过程引入的不确定度表示由测量过程引起的相对标准不确定度。以RELA样本A为例，每天上、下午各测定4次，共4天。均值（ ）：3.492μkat/L，标准差（SD）：0.021μkat/L。标准差即为标准不确定度，因此测量标准不确定度u测量=0.021μkat/L。则相对标准不确定度Urel测量=u测量/ =0.021/3.492=6.01×10-3。
4.2 计算相对合成标准不确定度
      相对合成标准不确定度即为各分量相对标准不确定度的平方和的根（公式2），

=0.95(%)。

4.3 计算扩展不确定度
      根据公式3，扩展不确定度UGGT=k×uc.rel=2×0.95%=0.019（95%置信水平，k为2）。
5．不确定度的报告
      报告测量结果x时应跟使用k=2计算的扩展不确定度（U）一起给出，因此RELA样本（A）GGT浓度：（3.492±0.067）μkat/L，k=2（0.067μkat/L=3.492×0.019）。［2008年RELA结果反馈，所有实验室GGT（A）均值：3.483μkat/L（1SD：0.079μkat/L）。本室结果见下图、表

      注：实验室编码74对应数据（图中红色指针处）即为我室结
      果，A、B分别为参考实验室外部质量评价计划样本A和样本B；
      e.u.为扩展不确定度；1μkat/L=60U/L。

讨 论
      随着我国检验医学水平的不断提高和检验工作的日益规范，以及近年来对检验标准化工作逐渐重视，量值溯源、测量不确定度等概念受到了越来越多的关注。溯源性是指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准（通常是国家测量标准或国际测量标准）联系起来的特性。量值溯源能可信地比较来自不同实验室的结果或同一实验室不同时期的结果。每个可溯源的测量结果应附有合理评定的不确定度，没有不确定度的测量结果是不完整的。而测量不确定度的应用则是计量科学的一个新进展，它与通常采用的误差是两个完全不同而互有联系的概念，是误差理论的进一步发展。不确定度的含义是指由于测量误差的存在，对被测量值的不能肯定的程度，也表明该结果的可信赖程度，是测量结果质量的指标。不确定度愈小，测量水平愈高，测量结果的使用价值愈高，反之亦然。
      测量不确定度的评定可使不同实验室对同一测量结果作有意义的比较，在常规的临床检验工作中，不确定度能帮助实验室人员有效地解释一些检测结果，如同一患者的多次测量结果可能不一致，但其波动在测量不确定度范围内，我们可认为各次差值在检测程序固有的变化范围内，无本质上的差异；再则，当患者结果在参考值附近或定性测量的临界值时，了解不确定度可有助于其临床意义的判断[4]。
     但测量不确定度的评估有一个非常重要的前提，即该实验室必须具备有效的质量保证和控制措施，可以确保过程稳定并受控。这些措施通常包括合格的工作人员、对设备和试剂的正确维护和校准、使用经过确认的分析方法、使用适当的参考、文件化的测量
程序、使用规定的内部质量控制程序、参加水平测试项目等[5]。
      在临床检验实际工作中，结果的不确定度可能有很多来源，例如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和容量仪器的不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定以及随机变化等。酶催化活性浓度的检测更有其特殊性，是通过监测酶催化反应的底物或产物转化速率来推算酶的催化活性，其检测过程受多种因素的影响，因而其不确定度来源显得更为复杂多样。由于临床检验工作的测量不确定度影响因素较多，各分量评定方法困难，再加上目前许多检测项目尚无可溯源的标准品，都给不确定度的评定带来了很大的困难，使得不确定度的评定目前仅仅局限于检验标准化工作和临床实验室质量体系中的一部分，导致现阶段尚无法在常规实验室的患者检验报告中使用。为此，需要临床实验室对包括不确定度评估在内的标准化工作做进一步探索，重视临床检验的标准化工作，建立完善的质量体系，最终实现实验室的检测结果具有溯源性和可比性。

参考文献
[1]ISBN 92-67-10188-9.Guide to the expression of uncertainty in measurement[S].
[2]ISO/IEC 17025:2005.General Requirements for the Competence of Calibration
and Testing Laboratories,ISO,Geneva(1999).
[3]ISO/DIS 15189.Quality Management in Medical Laboratories,ISO,Geneva(2000).
[4]刘小娟,江咏梅,王泓,等.临床生化检验测量不确定度的初步研究.重庆医学,2007,36(11):1086-1087.
[5]居漪,金大鸣,周华文,等.临床化学（血清葡萄糖）测定中测量不确定度评估的探讨.检验医学，2006，21（2）:178-180.

                                              摘自定向点金《临床实验室》杂志2009年第十期
                                                                     编辑：范伟伟