用飞行质谱技术筛选结直肠癌患者中特异性生物标志物的临床意义
高春芳1 赵光1 宋国英1 李冬晖1 王秀丽1 许洋2 马龙华2
1.解放军150中心医院外五科；2.美国Ciphergen Biosystems公司
【摘要】 目的 探讨蛋白质质谱分析方法鉴定结直肠癌生物标志物的临床应用价值。方法 用美国Ciphergen Biosystems公司金属亲和表面芯片(IMAC3)和蛋白芯片仪，检测146例结直肠癌患者，62名正常人，32例结直肠良性疾病患者血清蛋白质的相对含量。结果结直肠癌患者与正常人和结直肠良性疾病患者血清蛋白质在质荷比为4467 000~15122000，其中有10个蛋白质含量差异有显著意义。146例结直肠癌患者中有142例患者被正确检测，62名正常人和32例结直肠良性疾病患者均被正确识别，检测准确率为98.3% (236/240)，灵敏度和特异性分别为97.3% (142/146)和100%(94/94)。结论该方法灵敏度和特异性高，可快速、准确检测结直肠癌，其临床应用前景广阔。
【关键词】结直肠癌； 生物学标记； 光谱分析法
目前，结直肠癌已上升为我国肿瘤发病率的第三位，约有1/3的患者治疗时已属晚期。因此，寻找结直肠癌特异性早期诊断方法，是目前临床亟待解决的难题。本研究采用美国赛弗吉公司表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)，对结直肠癌患者和正常人及结直肠良性疾病患者血清蛋白质进行分析对比，筛选可用于结直肠癌早期诊断的血清蛋白质特异性生物标志物。
对象和方法
1．对象：本院结直肠癌患者146例，男97例，女49例，均经病理诊断确诊，其中Dukes A期20例，Dukes B、c和D期126例。正常健康人62名，男40名，女22名。结直肠良性疾病患者32例，其中结直肠腺瘤10例，家族性多发性息肉病6例，结直肠非肿瘤性息肉16例，男21例，女1 1例。年龄40~60岁，有相似的暴露史，均排除影响血清蛋白质含量的其他相关性疾病。
2．试剂和仪器：Cibacron Blue、尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA (Sinapinic acid)均购自美国Sigma公司，蛋白芯片生物系统(PBS II C)及其配套金属亲和表面芯片(IMAC3)购自美国Ciphergen Biosystems公司，癌胚抗原(CEA)酶联免疫检测试剂盒(郑州博赛生物实验研究所)。
3．标本采集：各采集全血4~5 ml，立即放人4℃ 冰箱静置3 h，4℃ 1 000 r/min离心30 min，吸取血清，按每管100 ul 分装，置-70℃保存。
4．标本准备：用Cibacron Blue除去血清白蛋质后，取20 ul，按1：7用pH7.0缓冲液(100 mmol/L磷酸钠，250 mmol/L氯化钠)稀释至150 ul。
5．芯片的预处理：芯片每孔加100 mmol/L硫酸铜50 ul，室温下200 r/min振荡5 min，弃硫酸铜，用去离子水冲洗5次后甩干，每孔中加入100 mmoL/L醋酸钠50 ul(pH4.0)室温下200 r/min振荡5 min，弃除未结合的铜离子。芯片每孔加入150 ul 结合洗脱缓冲液(50 mmol/L HEPES pH7.0)后，置振荡器上，室温孵育5 min后，弃缓冲液，重复1次。每孔加入50 ul 稀释标本，置振荡器上，4℃孵育60 min后，弃缓冲液。然后，用150 ul 结合洗脱缓冲液冲洗3次，每次振荡5 min，最后1次用1 mmol/L HEPES pH7.0快速冲洗，取出芯片，在每孔周围用疏水笔圈样品孔并风干，在EAM(SPA)中加75 乙氰和1%TFA 75 ul，充分振荡5 min，确保SPA全部溶解，离心1 min；每孔分2次加SPA(1 ul/次)，2次之间允许各孔风干。
6．芯片检测：用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，设定仪器参数，在Ciphergen ProteinChip软件中设定读片程序，以读取芯片数据。计算机以每秒1G HZ的速度，从所获得的原始数据快速精确的绘制出蛋白质质谱图。(1)蛋白质质荷比：结合EAM后的蛋白质在激光的轰击下电离，带有电荷的蛋白质在加速电场的作用下，不同质荷比的蛋白质在长度一定的真空管中飞行所需的时间不同，蛋白质的质荷比(M/Z)与离子飞行时间的平方T成正比。公式为：E=UZ：1/2 mv2 ；t=L/V推出M/Z= Kt2 =2U/L2 X t2 (注：Z为1离子所带电荷数，U为电压，v为飞行速度，L为真空管长度，K为常数)(2)蛋白质相对含量：带有正电荷的蛋白质离子束在到达检测器的一瞬间，电子倍增器将产生瞬时电流(I =Q/t，其中Q为t时，检测到的电荷数可转换成蛋白质的相对含量。
7．统计分析：用Ciphergen ProteinChip软件分析分组数据及相关性，用BioMarker Wizard软件对不同组相同质荷比的蛋白质含量数据进行方差分析。
8．结直肠癌组CEA检测：按CEA试剂盒说明书进行检测，正常参考值<5 ug/L。
结 果
1．质谱分析：设定参数分别对3组检测质谱图进行分析，有差异的蛋白质峰为36个(图1)，其中结直肠癌组与正常对照组和结直肠良性疾病组有35处蛋白质含量的差异有显著意义(P<0.05)。
2．3组蛋白质的对比：用SELDI-TOF-MS对146例结直肠癌患者、62名正常人和32例结直肠良性疾病患者血清蛋白质的组成作检测，发现分子量为4467000 、8131000、8939000、9000000、9134000、8221000、5369000、5928000、8324000和15122000的10个蛋白质组成的生物标志物，可将正常人与结直肠癌患者和结直肠良性疾病患者准确分组。分析这些生物标志物的数据，共产生7个终节点(图2)：其中终节点1、2、6为结直肠癌患者(142例)，满足-0.147[相应蛋白质相对含量(M)5928]、-0．467(M7941)、+0.527(M8131)、-0．695(M8221)、≤ -1.050 为终结点1，满足0.044 (M5342)、-0.060 (M6632)、+ 0.467(M75740)、+0.024(M7768)、-0.860(M8324)、- 0.193(M9192)、40.211为终结点2，满足-0.360(M8221)、≥2.213为终结6；终节点3仅为结直肠良性疾病患者(32例)，满足0.044(M5342)、-0.60(M6632)、+0.467(M7574)、+0.024(M7768)、-0.860(M8324)、-0.193(M9192)、>10.211；终节点7为48名正常人，满足0.288(M467)、-0.958(M8604)、≥0.373；终节点4和5被软件分别识别为12名和6名正常人，其中各有2例直肠癌患者，满足M1732≤0.721为终结点4，满足M8221≤2.213为终结点5。错误分组率：正常人和结直肠良性疾病患者均为0%，结直肠癌组为2.7% 。
3．3 组蛋白质分子量8 939 000的差异：正常人蛋白质质荷比为8 939 000蛋白分子量明显高于结直肠癌组和结直肠良性疾病组，而结直肠癌组又高于结直肠良性疾病组，经方差分析，3组间的差异均有显著意义(P≤0.01)。见图3，表1。
4．预测准确率：将10个有差异的蛋白质组成的生物标志物进行检测后，用BioMarker Pattern软件统计分析，结果显示，142例结直肠癌患者、62名正常人和32例结直肠良性疾病患者被正确分组，准确率为98.3% (236/240)。
5．特异性和敏感度：用SELDI-TOF-MS进行3组检测的灵敏度和特异性分别为97.3% (142/146)和100% (94/94)。4例漏诊结直肠癌患者中，Dukes B、C 期各2例。
6．CEA检测水平：用酶免疫法进行CEA检测，从146例结直肠癌患者中检出结肠癌88例，灵敏度为60.3% ；从对照组(94例)检出非结直肠癌患者22例，特异性为23.2% 。
7．重复性试验：用SELDI-TOF-MS对2样品孔进行测定，结果可满足Y=0.9865x+0.098 R =0.958 3条件，说明重复性好，试验结果可靠(图4)
讨论
目前，我国结直肠癌发病率呈升高趋势，5年生存率为50%，其原因是缺乏特异性高的早期诊断方法。以往蛋白质研究多采用色谱分离纯化、二维电泳、光谱、质谱定量或定性等分析化学的方法，而这些方法所需技术条件高，仪器昂贵，步骤繁琐，耗时，不适于大规模筛查和临床检测。蛋白质芯片根据层析技术和质谱技术发展而来，其表面为可结合蛋白质的固体点，故该技术的特异性和灵敏度高，且可将传统方法检测不到的蛋白和多肽检出。然后，再用SELDI-TOF-MS技术将患者和正常人的质谱图，甚至基因库中的质谱图进行对照分析，以发现和捕获新的特异性疾病相关蛋白及其特征，并快速获得尽可能多的蛋白质组学信息和发现新的肿瘤标志物。其优点是：可直接从原始的样品中进行捕获、检测与分析，灵敏度高(检测范围为1~50 fmole蛋白质)，检测范围广(500~500 000)，所需样品体积小(0.5 ul~400 ul)；检测简便，整个测定过程一般为30 min，且敏感性和特异性高；同时不会破坏所测定的蛋白质；结果可靠，还可重复检测 。
Petricoin等已用SELDI-TOF-MS技术从血清中筛选诊断卵巢癌的特异性生物标志物，Adam等则用SELDI蛋白芯片系统从血清中筛选出可诊断前列腺癌的特异性生物标记物。本研究用IMAC3-Cu芯片对146例结直肠癌患者、62正常人和32例结直肠良性疾病患者血清蛋白质作对比分析，结果发现，血清中质荷比4 467 000~15 122 000间的10个蛋白质相对含量在3组中的差异有显著意义，如图3和表1所示，3组质荷比为8 939 000的蛋白质相对含量差异亦有显著意义，10个蛋白质所组合成的分组检测结直肠癌的灵敏度(97.3%)和特异性(100% )均高于CEA 检测(60.3% 和23.2% )。说明该方法对结直肠癌的复发和转移的诊断有重要意义，并可作为临床上观察疗效的指标之一。
此外，本检测结果与病理诊断结果比较，仅Dukes B、C期结直肠癌患者各有2例漏检，而Dukes A期结直肠癌患者无漏检，表明此生物标志物不仅可以用于中晚期结直肠癌的诊断，更具有意义的是可准确诊断Dukes A期结直肠癌。因此，我们认为SELDI 技术筛选出的特异性生物标志物可用于结直肠癌的早期诊断，该方法是一种可靠的适用于结直肠癌普查的方法。
编辑：范伟伟
