生化大咖和您聊聊K值
聊聊K值（IFCC推荐法ALT的检测）
IFCC推荐法
测定ALT的原理
IFCC推荐法测定ALT活性是采用速率法，其酶偶联反应为：L-丙氨酸与α-酮戊二酸在ALT催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，丙酮酸和还原型辅酶Ⅰ在LDH催化下生成L-乳酸和辅酶Ⅰ。上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中ALT酶活性呈正比，在340nm波长处监测吸光度下降速率，可计算ALT的活性单位。
水定标？
请问您实验室ALT是水定标么？（YP体系用水定标，是对体系有信心的表现?如何进行K值校准？还是一直就是这么水定标？）
这里定标（或者说校准）这个词改为水空白，是不是更合适？
酶活性浓度的单位
国际单位（IU） ：在特定的条件下，每分钟转化1mmol底物的酶量为一个国际单位。以IU表示，1IU=1mmol.min-1。由于没指定温度、各家实验室不是上述的特定条件，所以不建议临床实验室用IU，而应该用：U。
摩尔吸光系数法
用连续监测法进行酶活性测定时，不需做标准管或标准曲线，根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。
摩尔吸光系数的定义：在特定条件下，一定波长的光，光径为1cm时，通过所含吸光物质的浓度为1mol/l时的吸光度。
用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸光系数可以进行酶活性浓度的计算。检测到线性期内的每分钟吸光度变化即△A/min，其酶活性计算公式即为
ALT的检测非常简单：线性期、 △A/min；
关键就是K值定准
系数K
ε：摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）；
b：比色杯光径（cm）；
Vt：反应体系体积（ml）；
Vs：样品量（ml）；
106：将mol换算成umol。
建立了酶的测定方法后，其ε、Vt和Vs均为定值，不同分析仪中b不同，但自动化分析仪一般都自动换算为1cm，因此K值为一个定值。
K值越大越好？
减少了稀释的机会
K值就是一斜率 ：酶活性就是K乘以△A啊。
调整K值的办法是什么？
改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度，稀释倍数愈大，K值愈大（线性范围越大）。
线性范围越大就一定好么？
牺牲了精密度（稳定性）
所以不建议更改试剂说明书中样本和试剂的比例。
三种K值
指示物的摩尔吸光系数，本实验即εNADH会受很多因素影响，所以有理论K值、实测K值和校准K值之分。
（1）理论K值：根据公式K=1/ε×1/b×Vt/Vs×106，依据理论摩尔吸光系数（如εNADH=6.22×103）计算所得。
（2）实测K值：根据NADH实测摩尔吸光系数计算ALT的K值，即实测K值。
（3）校准K值：通过具有溯源性的酶校准物直接校准得到的K值。
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理论K值：根据公式K=1/ε×1/b×Vt/Vs×106，依据理论摩尔吸光系数（如εNADH=6.22×103）计算所得。
NADH的理论摩尔吸光系数（340nm）是6.22×103，是用严格校准波长及光径后窄半波宽的高级紫外分光光度计，手工方法测定的。
ε对特定物质而言，在温度、波长及溶剂条件一定的情况下是一个定值，但在一些外界条件（波长、温度、pH值等）影响下也会有所变化。况且理论εNADH是在特定单波长下获得的，我们实际酶检测时为了消除干扰，常使用双波长分析，则不能再用此值。
虽然IFCC已推出血清酶活性测定的推荐方法及试剂配方，但由于分析光学系统和波长、谱带以及测定过程等方面存在差异，以及不同厂家试剂间底物浓度、缓冲液组成、pH、辅酶纯度及浓度等方面也存在差异，导致以理论K值计算出酶活性结果缺乏可比性。
随着时间的推移、仪器老化，同一台仪器、同一套检测系统内的K值也往往会发生变化。所以理论K值只能供用户求实测K值时参考，不能直接用于酶活性浓度的计算。
理论K值：根据理论摩尔吸光系数（NADH=6.22×103），依据下列公式来计算获得。
比如建立了以下ALT测定方法：血清量50ul，底物液为1ml，比色杯光径为1cm，则理论K=1.05×106/(6.22×103×0.05×1)=3376。
一般不能直接使用，仅作为计算实测K值或校准K值时参考。
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实测K值：根据NADH实测摩尔吸光系数计算ALT的K值，即实测K值。
NADH（340nm）的实测ε可用葡萄糖己糖激酶法实测，紫外法测定葡萄糖的反应系统（如HK法）可产生与葡萄糖等摩尔的NADH，用已知浓度的葡萄糖校准液测得相应的吸光度，计算实测ε值。本实验需要有质量可靠的校准品与试剂盒，还要求仪器有良好的精密度。
一般实测εNADH>6600或<6000为不合格。
实测K值：根据NADH的实测ε值计算所得。
可用葡萄糖（HK法）实测NADH的摩尔吸光系数。测已知浓度的葡萄糖校准液，按公式ε=△A×Vt/Vs×1/b×1/C×1000，计算NADH的摩尔吸光系数。
ε：摩尔吸光系数；△A：As-Ab；Vt:反应总体积ml；Vs：样本体积ml；b：比色杯光径cm；C：葡萄糖校准液浓度。为提高加样的准确性，将样品与试剂的比例调整为1:20，样品15ul，试剂300ul，样品稀释液5ul，37℃340nm比色，反应6min，确保反应完全。
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校准K值：通过具有溯源性的酶校准物直接校准得到的K值。
IFCC提出酶活性的检测必须使用完整的检测系统，依靠定值校准血清实现溯源，使各实验室检测结果具有广泛可比性。
具有溯源性的酶校准品能对试剂、仪器及测定全过程进行校准，可消除不同检测系统和同一检测系统本身固有的系统误差的影响，实现酶测定结果准确性的传递，使检测结果具有较强的可比性。
使用公认的酶校准物对K值进行校准，是国际上目前酶测定标准化的新途径，使用酶校准物的优点：除具有实测ε值换算出K值所具有的一切优点外；还可以促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。
校准K值：通过校准物直接校准得到的K值，实现溯源，使各实验室检测结果具有可比性。
校准K值=(C2-C1)/(A2-B)，其中C2为校准血清浓度；C1为三蒸水浓度，取值为0；A2为校准血清吸光度，B为本地吸光度值。
ALT有两种校准办法
现在可以回答了，ALT有两种校准办法：
1. 根据NADH实测摩尔吸光系数计算ALT的K值，即实测K值。（葡萄糖己糖激酶法实测）
2. 通过具有溯源性的酶校准物直接校准得到的K值。
一般每半年进行一次酶活性的校准，但日常工作中遇到下列情况时，必须进行校准：
①试剂盒改变厂家，或者更换了批号；
②仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者换了重要部件；
③质控反映出异常的趋势或偏转，或者超出实验室规定的接受限，采取一般纠正措施后，不能识别和纠正问题时。
校准K值与实测K值之间也存在一定的差距，即使指示物和仪器相同，其差异可能由试剂及校准品造成的(溯源性问题)。
下面了解一下NADH
ALT的定量实际上就是检测NADH的减少
下面了解一下NADH
NADH，还原性辅酶I，学名还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，是很多生物体内化学反应中的递氢体。NADH呈还原态，其氧化形式为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，氧化态），NAD+在脱氢酶的作用下接受氢离子，形成NADH。NADH在260nm和340nm有两处吸收峰，而NAD+在340nm无吸收峰，基于这种340nm的吸收峰的增加（形成NADH）和衰减（形成NAD+）可以在该波长检测多种酶的活性。
NADH会受很多因素影响
比如PH(可以实验观察)
观察NADH 在不同pH环境下的稳定性
（1）调配好的试剂用NaOH或HCl滴定成pH值6.5;7.0;7.5;8;8.5,9.0;9.5的不同pH值环境。
（2）每天分别于分光光度计读取340nm处OD值
（3）计算吸光度变化速率
（4）求出NADH下降最慢的pH值，即NADH稳定性较好的PH值。
一般pH>8，Tris缓冲液有利于NADH的稳定。但酶促反应受环境pH的影响极为显著，每个酶都有最适pH。所以ALT试剂盒除了考虑NADH的稳定性之外还需考虑ALT的最适pH。一般ALT试剂盒的最终pH为7.15±0.05。
