关明教授：同源重组修复缺陷在乳腺癌发生风险和治疗中的临床价值

作者：陈彦丽关明复旦大学附属华山医院检验医学科 2023-08-03

文章刊载于《临床实验室》杂志2023年7月刊“临床分子诊断”专题-「实验室诊断技术导航」版块页码p50-p55

【摘要】乳腺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的主要原因。DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）途径缺陷是导致乳腺癌发生的潜在原因。同源重组修复（homologous recombination repair，HR）途径修复DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs），是一种高精度的DNA修复机制。因此，HR通路基因的突变失活会导致同源重组修复缺陷（homologous recombination repair deficiency，HRD），增加患乳腺癌的风险。当细胞存在HRD时，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（poly ADP ribose polymeraseinhibitor，PARPi）与其发挥合成致死效应，导致DNA损伤无法修复，细胞死亡。目前，基于多项临床试验结果，PARPi的临床适应症得到逐步获批，越来越多的乳腺癌患者从其治疗中获益，HRD的临床检测也越来越普及。因此，在分子水平上不断探究HRD与乳腺癌发生发展之间的联系，这有助于为患者提供更多的治疗靶点及预测治疗效果。

乳腺癌是目前全球最常见的恶性肿瘤，发病率约占女性癌症的30%，死亡发病比（mortality-to-incidence ratio，MIR）为15%。DNA损伤修复缺陷会影响基因组的稳定性，导致乳腺癌的发生。DNA损伤可分为两大类：DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）和DNA单链断裂（single-strand breaks，SSBs）。DSBs的修复有两条途径：同源重组修复（homologous recombination repair，HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）。HR利用同源姐妹染色单体上相同的遗传信息作为临时模板以替代受损DNA的核苷酸，可实现对DSBs的精准修复。当HRD存在时，DSBs会过度依赖NHEJ等低保真度、易错的替代性DNA损伤修复途径，从而极可能造成核酸序列的插入/缺失，拷贝数异常，并引起染色体交联，造成基因组和染色体不稳定，导致乳腺癌的发生。据文献报道，高达40%的家族性和散发性乳腺癌患者存在HRD，因此，在分子水平上探究HRD与乳腺癌发生发展之间的联系，这有助于为患者提供更多的治疗靶点及预测治疗效果。本文重点论述述了HRD在乳腺癌发生风险和治疗中的作用。

同源重组修复途径

HR途径依赖于细胞周期，即在S期和G2期发挥作用。在HR开始时，DSBs被三聚体复合物（MRN复合物）识别。该复合物由MRE11，RAD50和NBS1组成。MRN招募并激活检查点激酶ATM，使参与DNA损伤信号传导的一系列蛋白发生特定部位的磷酸化。例如，在DSBs位点及周围，ATM磷酸化染色质组蛋白H2AX的139位丝氨酸（Ser139），形成γH2AX。MDC1通过其磷酸化蛋白与BRCT结构域的相互作用直接结合到γH2AX上，招募并辅助激活DSBs位点其他的ATM，从而放大和传播DDR信号。此外，CHK1、CHK2和ATR也参与DSBs的信号传导，并直接启动细胞周期阻滞，允许DSBs修复。DSBs周围染色质的结构变化导致53BP1（参与NHEJ）与DSBs位点周围甲基化的组蛋白结合。最终，BRCA1与C端结合蛋白相互作用蛋白（C-terminal binding protein interacting protein，CtIP）结合，然后进一步与MRN复合物相互作用。一旦必需的蛋白质被招募到DSBs位点，DSBs末端切除启动。MRE11依赖的DNA末端切除需要CtIP的参与，并由BRCA1催化，BRCA1促进53BP1消除/重塑，使其远离DSBs位点，从而促进HR介导的DSBs修复。MRN、CtIP和BRCA1的相互作用使5’端DNA链切除，暴露出3’端DNA单链。3’端DNA单链被复制蛋白A（replication protein A，RPA）快速结合/包裹，形成核蛋白丝，从而保护其不被降解。随后，RPA被PALB2取代，并招募BRCA2，BRCA2装载重组酶RAD51，在XRCC2、XRCC3和RAD52等的介导下取代RPA。通过上述步骤，形成RAD51-3’端DNA单链-核蛋白丝复合物，该复合物侵入双链姐妹染色单体内的同源位点，在该位点上，形成了一个瞬时位移环，其功能相当于一个瞬时复制叉，允许复制机制以无错误的方式替换受损/切除的DNA，之后产生的Holliday交叉被解决，DNA的无错误修复完成。

同源重组修复缺陷与乳腺癌发生风险

多个基因参与了HR通路，其中BRCA1和BRCA2是该通路的关键基因，目前被研究的最多。HR通路基因或基因组调控区域（如启动子/增强子）内的任何突变都可能使基因无法正常表达，或影响所编码蛋白的正常功能，从而影响功能性HR蛋白的合成，导致同源重组修复缺陷（homologous recombination repair deficiency，HRD）和DSBs的异常修复。

许多因素都可能导致HRD。HR基因的表观遗传修饰，如BRCA1和RAD51C的启动子超甲基化，下调基因的mRNA表达，已被证实与HRD相关。一些染色体的结构重组也可能导致HRD，包括杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）、端粒等位基因不平衡（telomeric allelic imbalance，TAI）和大片段迁移（large-scale state transition，LST），这些基因组特定改变也被称为“基因组瘢痕”。LOH被定义为肿瘤基因组中存在杂合性缺失区域大于15 Mb且小于整个染色体长度，因为这一长度的杂合性缺失通常是由于HR以外的替代修复途径产生的，与存在HRD的肿瘤高度相关。TAI被定义为延伸到其中一个亚端粒但不超过着丝粒且大于11 Mb的等位基因不平衡的染色体片段，这种基因组异常特征与其对铂类药物的敏感性相关，反映出存在HRD的细胞DNA复制错误。LST定义为两个相邻区域（两个区域长度均大于等于10 Mb，同时区域间距小于3 Mb）之间的染色体断裂位点，研究发现该特征能预测BRCA1/2的失活，肿瘤基因组截断点的总数可以用来描述基因组的不稳定性。

然而，文献报道最多的导致HRD的原因是编码核心HR蛋白的基因编码区内发生的致病突变，这种突变可能是胚系的，也可能是体细胞突变。BRCA1和BRCA2的胚系突变是HRD最常见的原因，BRCA1/2突变会下调HR，从而倾向于更容易出错的DSBs修复途径（如NHEJ），修复过程中错误的积累增加了乳腺癌的发生风险。携带BRCA1/2致病突变的个体具有患乳腺癌的高风险（相对风险为5或更高），BRCA1/2被归类为高外显率乳腺癌基因。携带BRCA1致病突变的女性终生罹患乳腺癌的风险为72%，BRCA2相应的风险为69%。大约50%的遗传性乳腺癌是由BRCA1/2胚系致病突变导致的，并多为早发性乳腺癌。约15%~20%的三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）患者与BRCA1/2致病突变有关，其中与BRCA1致病突变相关的乳腺癌中，有70%~85%是TNBC。10%~15%的高危Luminal型乳腺癌患者携带BRCA1/2致病突变。

但是，BRCA1/2突变并不能解释乳腺癌中的所有HRD，这表明其他HR通路基因的突变失活也会导致HRD。HR基因包括PALB2、ATM和CHEK2，已被证实会显著增加乳腺癌风险（相对风险为2~5），被归类为中等外显率基因。PALB2胚系致病突变的携带者，80岁时患乳腺癌的风险为53%，家族性乳腺癌患者中PALB2的致病突变频率为0.6%~3.9%。结合后续文献报道，PALB2的突变会导致5倍或更高的乳腺癌风险，因此，目前PALB2被列为遗传性乳腺癌的高风险基因。

HR通路的其他基因，如MRE11、RAD50、NSB1和RAD51等，与乳腺癌发生风险的关系也被进一步探究，然而，由于文献报道的结果相互矛盾与这些基因突变相关的风险水平尚不清楚。因此，需要继续研究某些HR通路中的中风险基因，以进一步明确它们在增加乳腺癌风险中的作用。

目前，随着二代测序技术的发展，HR通路的多基因检测已在国内外乳腺癌患者中广泛开展。Couch等人对来自多个中心的1824例TNBC患者进行了17基因检测组合的致病突变检测，其中HR通路基因详细突变情况如下：BRCA1的突变频率为8.5%，BRCA2为2.7%，PALB2为1.2%，BARD1为0.5%，BRIP1为0.44%，RAD51D为0.38%，RAD50为0.33%，RAD51C为0.33%。Li等人对中国遗传性乳腺癌患者进行的多中心研究发现，BRCA1的致病突变频率为8.8%，BRCA2为8.6%，PALB2为1.2%，ATM为0.6%，CHEK2为0.6%，BARD1为0.5%，BRIP1为0.3%，RAD50为0.2%。尽管多基因检测已普遍开展，但其临床实践仍存在一些挑战：筛选能从检测中获益的患者、待检基因的选择和组合以及对突变结果的解读，尤其是低或中等外显率基因的突变和意义不明确突变（variants of unknown significance，VUS）。

同源重组修复缺陷与乳腺癌治疗

由HRD引起的基因组不稳定性可能使癌细胞容易受到化疗药物的影响，尤其是那些直接损伤DNA的药物，如蒽环类药物或铂类药物。多项临床前试验和临床试验结果表明：存在HRD的肿瘤确实可以从蒽环类药物或铂类药物等化疗药物中获益。虽然铂类药物在BRCA1/2突变的乳腺癌中有一定的治疗效果，但伴随的显著毒性也不容忽视，患者可能因毒性而减少用药剂量或停药，从而导致疾病进展。因此，基于合成致死效应的靶向治疗应运而生。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂（poly ADP ribose polymerase inhibitor，PARPi）是第一批基于合成致死效应被开发并被允许用于临床的药物。PARP能够识别SSBs，并通过碱基切除修复（base excision repair，BER）途径进行DNA损伤的修复。当PARP被抑制后，SSBs累积并转化为DSBs，若细胞同时存在HRD，则两者发挥合成致死效应，导致DNA损伤无法修复，细胞死亡。多项临床试验评估了PARPi对BRCA1/2突变乳腺癌的治疗效果。几项针对晚期乳腺癌的研究，包括ICEBERG1、OlympiAD、EMBRACA和BROCADE3等，已证实PAPRi对晚期BRCA1/2突变的TNBC有益。基于以上试验结果，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准使用奥拉帕利治疗存在胚系BRCA1/2突变的HER2阴性乳腺癌患者。一些试验还探究了PARPi对未选择（BRCA1/2野生型或未知突变状态）的TNBC患者的治疗益处，这些研究的假设是基于部分肿瘤存在HRD，PARPi可能在临床上显示出治疗效果。在某些研究中也发现，部分患者对PARPi的治疗没有反应，反而表现出治疗毒性，这提示我们需要根据HRD的状态来筛选可能从PARPi治疗中获益的患者。

为了对PARPi在治疗上加以利用，首先有必要识别出存在HRD的乳腺癌，因此研究者们开发出了几种假定的生物标志物。首先，Myriad HRD用于检测基因组中的结构重排，并对肿瘤进行HRD评分，基于该评分可以预测患者PARPi的临床获益情况。此外，由Davies等人于2014年开发的HRDetect检测显示：存在BRCA1/2缺陷的乳腺癌患者比例可能比预估的要高，这些患者可能从PARPi治疗中获益。“BRCAness”被用于描述在没有BRCA1/2胚系突变的情况下，具有潜在HRD的肿瘤。在这类肿瘤中，其他HR基因的突变，BRCA1/2（可能还有其他HR基因）启动子的甲基化，或通过转录调控使这些基因表达降低，都可能在未发现明确突变的情况下解释HRD。HRD的另一个潜在的生物标志物是DNA损伤应答缺陷（DNA Damage Response Deficiency，DDRD）特征。这一特征确定了一组DDRD患者，其特征是免疫过程上调，因此该检测已被重新命名为DNA损伤免疫应答（DNA Damage Immune Response，DDIR）检测。该特征已被证实可预测在辅助和新辅助化疗时对DNA损伤化疗药物的反应，并且可能比其他分析更具优势，因为它反映了当前肿瘤内对HR缺陷的生物学反应。相比之下，上述讨论的几种标志物主要检测由HRD引起的“基因组瘢痕”，检测的是HRD的不可逆和可遗传的最终产物，这可能更能反映肿瘤的进化史，而不是当前的肿瘤生物学。然而，在临床应用中，如何实现对HRD全面而准确的评估仍具挑战。

这与其他化疗药物相似，PARPi也面临耐药问题。尽管PARPi在BRCA1/2致病突变乳腺癌的治疗中取得了显著的成功，但其中超过40%的患者对PARPi的治疗无反应。此外，那些最初对治疗有反应的患者在长期使用后获得PARPi抗性，导致疾病进展。现在已发现的一些PARPi的耐药机制包括PARPi外排，回复突变恢复HR功能，通过上调NAD+合成来释放PARP，沉默BP53，PARP发生点突变和复制叉重新稳定后复制速率增加等。针对PARPi的耐药问题，PARPi与其他药物联合应用的效果引起了研究者们的广泛关注。目前有前景的药物组合包括PARPi联合抗血管生成药物，PARPi联合免疫治疗，PARPi联合PI3K/AKT通路抑制剂，PARPi联合Ras/Raf/MEK/MAPK通路抑制剂，PARPi联合ATR/WEE1抑制剂和PARPi联合表观遗传修饰。然而，联合治疗往往涉及更严重的毒性问题，因此需要从分子层面上进一步描述肿瘤在PARPi治疗中的进展情况，从中获取有意义的应答分子标志物，筛选能从各类联合治疗中获益的患者。

结论与发展趋势

HR通路是DSBs的关键修复途径，HR基因的突变失活和部分染色体结构重组都会导致HRD，HRD状态对乳腺癌的发生风险和肿瘤治疗有显著的影响，是乳腺癌患者的关键治疗靶点。在临床实践中，迫切需要开发强大的、有效的生物标志物来识别HRD肿瘤，以筛选能从PARPi治疗中获益的患者。随着PARPi在临床的广泛应用，其耐药问题也不容忽视，PARPi与其他药物的联合应用可能是未来临床发展的趋势。

【来源：《临床实验室》杂志2023年7月刊】

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