质谱筛查新生儿遗传代谢病阈值范围应该是多少？

从2008年12月1日到2010年12月1日有45个国家130个实验室参与了一项调查，寻求通过世界性合作找到更合理的以串联质谱法进行新生儿遗传代谢病筛查的阈值。在此期间，共提供了2500-3000万正常新生儿及10742名匿名的阳性测定结果，测定样品是干血片，测定内容包括氨基酸和酰基肉碱。

该合作项目始于2005年6月。自2010年12月1日起，美国大部分州，加拿大，墨西哥中美洲，拉美，非洲，欧洲，中东，南亚，东南亚的一些国家，大洋洲的澳大利亚，新西兰，台湾，日本，韩国等地均已参与了该项目。美国的47个州和波多黎各是积极的参与者。国际上有45个国家超过80个项目参与进来。

数据提交网站

R4S是一个经过专门设计和编码的应用，用于收集和报告任何基于数字结果的可能类型的新生儿筛查数据。历经过去5年的发展，该项目日趋完善，通过使用计算机程序调整基于网络的数据收集系统使之符合不同国家用户的需求。登录以后，用户有权访问其数据提交筛查程序特有的文档和和比较工具，同时有权访问一个包括30多项项目工具和报告的共享文件夹。

数据提供内容

参与者提交5种类型的数据：（a）每项测定的5个选定的百分位数在正常人群中的比率；（b）全部用于日常筛查的阈值；（c）真阳性病例（根据各参与国本地的程序、专业指南等确立，例如ACMG）的全部氨基酸和酰基肉毒碱检测结果；（d）本地的执行情况，如受检率，假阳性率和阳性预测值等）；（e）对多项选择问题的回答（例如：试剂来源，是否衍生，采集日期和血点大小）。

百分位数

以标准的统计学方法计算每一个标志物的5个百分位数值（1%，10%，50%，90%和99%）。2010年12月1日时，102名参与者累积提交25108个百分位数值。标本采集时新生儿的年龄为24-48小时（57%的参与站点）、3天（34%的参与站点）或5天（9%的参与站点）。每个百分位数值取自由数百到超过百万的病例数。单以明尼苏达州的项目为例，其百分位数值是从2004年7月1日至2010年8月31日期间由MS/MS测试的517283个新生儿数据计算出来的。虽然在每一个参与点对进入计算百分位数的的总数无法保持恒定，但在计算执行状况（真阳性、假阳性、假阴性以及真阴性的总数，由59%参与者提交了相关数据）时可使用数据外推法，完成对大约2500-3000万例的新生儿的群体做出估测。

阈值（Cutoff值）范围

在2010年12月1日时，133名参与者已经提交了5341个阈值（638个低阈值和4703个高阈值）。，这些阈值归类为24个低阈值和90个高阈值。阈值分为5类：氨基酸、氨基酸比，酰基肉碱，酰基肉碱比例和继发测试。标准单位为mol/L参与站点间所使用的阈值数量差别很大（2-114，平均44）。但是，当某项测定的阈值受到合作项目的重视时，参与单位往往倾向于加入相关的阈值。

阳性病例

阳性病例归类为25种氨基酸代谢病、18种脂肪酸氧化障碍和22个有机酸代谢病。在提交为“正常”的例子中有75份事后根据临床表现被判断为假阴性，因此很有可能还有一些假阴性未被发现。在发现的假阴性中，非酮高甘氨酸血症（OMIM#605899），I型酪氨酸血症（OMIM#276700），鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷（OMIM#300461）和不同类型的甲基丙二酸血症（Cbl A，B；OMIM#251000,2511100,251110）较多出现。数据库还包括从文献中提取的670个病例（6.3%），这些病例不会是重复录入，因为发表这些病例的实验室并未参加本合作项目。符合下列条件的病例可考虑符合阳性病例：（a）生化诊断确认，根据本地协议体外诊断确认；（b）结果仅来自第一份标本（无重复样品）；（c）采集时间在1-7天内。网站中另一项应用将被激活处理第二份样品所得到的相同资料。从2008年12月1日至2010年12月1日真阳性病例平均提交率为5.1例/天（3651个病例）。真阳性病例总数接近11000，每种病的病例数量范围是1-2057，中值47。

阈值区间和调查结果

本项研究的主要目的是提供用MS/MS方法测定的各项指标的阈值范围。阈值包括高于或低于正常人群的范围。对同一个检测指标而言，高阈值范围指的是正常人群第99百分位数与真实病例的第5百分位数之间的范围，低阈值范围指的是真实病例的第99百分位数与正常人群第1百分位数之间的范围。收集数据时注意到了衍生与非衍生的的检测结果。表一列出了正常新生儿群各检测项目在第一、第50和第99处的百分位数。除了精氨酸琥珀酸（Asa）和琥珀酰丙酮（Suac），其他氨基酸的中值变异为23%，酰基肉毒碱为27%。

表一  新生儿串联质谱测定氨基酸和乙酰肉碱各检测项目的累积百分位数

Ala, alanine; Arg, arginine; Asa, argininosuccinic acid; C0, free carnitine; C10:2, decadienoylcarnitine; C10:1, decenoylcarnitine; C10, decanoylcarnitine; C12:1,dodecenoylcarnitine; C12, dodecanoylcarnitine; C14:1, tetradecenoylcarnitine; C14, tetradecanoylcarnitine; C14:2, tetradecadienoylcarnitine; C16-OH, hydroxy palmitoylcarnitine;C16:1-OH, hydroxy hexadecenoylcarnitine; C16, palmitoylcarnitine; C18:1-OH, hydroxy oleylcarnitine; C18:2, linoleylcarnitine; C18:1, oleylcarnitine;C18, stearylcarnitine; C18:1-OH, hydroxy oleylcarnitine; C18-OH, hydroxy stearylcarnitine; C2, acetylcarnitine; C3, propionylcarnitine; C3DCC8-OH, malonyl-/hydroxy octanoylcarnitine; C4, butyryl-/isobutyrylcarnitine; C4-OH, hydroxy butyrylcarnitine; C4DC, succinyl-/methylmalonylcarnitine; C5, isovaleryl-/2-methylbutyrylcarnitine;C5-OH, hydroxy isovalerylcarnitine; C5:1, tiglylcarnitine; C5DC  C10-OH, glutarylcarnitine plus hydroxy decanoylcarnitine; C6, hexanoylcarnitine; C6-OH,hydroxy hexanoylcarnitine; C6DC, methylglutarylcarnitine; C8, octanoylcarnitine; Cit, citrulline; CV, coefficient of variation (calculated from values within theinterquartile range: median  [(75%ile–25%ile)  1.5]); (D), derivatized (see text for details); Gln, glutamine; Glu, glutamic acid; Gly, glycine; Met, methionine; N,number of participants who have submitted %ile values; Phe, phenylalanine; Suac, succinylacetone; Tyr, tyrosine; (U), underivatized; Val, valine; Xle, isoleucine and leucine.

对于参与到本合作研究中的10679例阳性病例，按照病种研究了他们在8个百分位点上的数值。由于一项测定指标往往不止与一种疾病状况联系。决定一项指标是否与某种临床意义的办法是：看是否某种临床病症有一半都显示该指标超出正常范围，表二列出了氨基酸、乙酰肉碱和相关比值偏低的阈值范围，表三和表四分别列出了氨基酸、乙酰肉碱和相关比值偏高的阈值范围。

表二    氨基酸、乙酰肉碱和相关比值低阈值的阈值范围

a  This column indicates an override (O/R) of the target range first element (99%ile of the cumulative disorder range) to increase specificity and reduce the occurrence of false positive results.

b  This column indicates an override (O/R) of the target range second element (1%ile of the cumulative normal population) to increase sensitivity and reduce a significant risk of false negative results.

c  ACs/Cit, (C0C2C3C16C18:1)/Cit ratio. For abbreviations of other analytes, see legends of Table 1.

NA, not available.

表三    氨基酸和相关比值高阈值的阈值范围

For abbreviations of analytes, see legends of Table 1.

a  This column indicates an override (O/R) of the target range first element (99%ile of the cumulative normal population) to increase sensitivity and reduce a significant risk of false negative results.

b  This column indicates an override (O/R) of the target range second element (5%ile of the cumulative disorder range) to increase specificity and reduce the occurrence of false positive results.

表四    乙酰肉碱和相关比值高阈值的阈值范围

The symbol “&” between two markers indicates isobaric compounds with the same molecular weight. (D), derivatized and (U) underivatized (see text for details). For abbreviations of analytes, see legend of Table 1.

a  This column indicates an override (O/R) of the target range first element (99%ile of the cumulative normal population) to increase sensitivity and reduce a significant risk of false negative results.

b  This column indicates an override (O/R) of the target range second element (5%ile of the cumulative disorder range) to increase specificity and reduce the occurrence of false positive results.

本项世界性合作项目目的在于旨在提高新生儿MS/MS筛查的质量。希望收集足够的证据来提供临床使用的检测阈值（Cutoff值）。过去通常建立cutoff值的方法是收集正常人群的数据取得均值并加上若干标准差来做为阈值，这其实是用完全来自正常人群的数据计算得出的阈值的一种方法，往往导致许多假阳性的出现。本合作研究是希望通过大量的调查，找到在正常组和病人组之间的区域来定义cutoff值，希望这些阈值区能更贴近临床。

本项合作并没有结束，目标是希望对每一种罕见病都能收集到50例以上。在此过程中将会与现已完成的收集一样，有可能找到更多的指标与疾病的关联及发现每种指标有可能对多种疾病都有所关联。

本文资料主要来自“Clinical validation of cutoff ranges in newborn screening of metabolic disorders by tandem mass spectrometry: A worldwide collaboration project” (Genetics in Medicine 13:230-254, 2011)。

翻译：王小茜

审校：姚志建