新型冠状病毒抗体检测在疫情防控中的应用价值
何书宇，医学硕士，现任广州万孚生物技术股份有限公司资深产品经理，2012年毕业于哈尔滨医科大学基础医学七年制专业，长期从事于IVD和第三方临床检测技术服务行业，曾于《Autophagy》等杂志发表SCI论文3篇、核心期刊论文1篇。
新型冠状病毒肺炎（COVID-19）在全球范围具有很高的传播风险，对人类健康安全造成巨大威胁。截至2020年3月3日北京时间17点，全球72个国家共计报告90870例确诊病例，其中中国共确诊80304例[1]。新型冠状病毒（2019-nCoV）是已知可感染人类的第7种冠状病毒，属于冠状病毒β属，基因组为线性的单股正链RNA，人群具有普遍易感性[2]。新冠肺炎与同属冠状病毒感染的SARS、MERS在病理特征上具有一定相似性[3]，2019-nCoV与SARS-CoV和MERS-CoV分别有约70%和40%的基因序列相似性[4]。早期病例表明，2019-nCoV感染可能不如SARS-CoV和MERS-CoV感染导致的症状严重。但是，发病数迅速增加以及越来越多的人际传播证据表明，该病毒比SARS-CoV和MERS-CoV更具传染性[5]。
基于免疫学方法的病毒特异性抗体检测，具有灵敏度和特异性较高、检测快速、操作便捷等特点，可以突破病毒核酸检测技术对人员和场所的限制，有效促进患者检测效率和检出率提升，对新冠疫情控制具有重要意义。
一、特异性抗体IgM和IgG在新型冠状病毒肺炎病程中的意义
临床免疫学机理表明，不同病原体都是激发机体免疫应答的抗原物质，病原体感染机体后这些抗原能诱导宿主产生体液免疫/细胞免疫应答。作为体液免疫应答中的关键组成部分，免疫球蛋白（即抗体）主要为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。IgM和IgG的作用最为关键，IgM是初次免疫应答中最早出现的抗体，亲和力较低，持续时间较短，IgM阳性提示急性期感染。IgG发挥主要保护作用，是再次免疫应答产生的主要抗体，产生较晚，亲和力较强，持续时间较长，IgG阳性提示病情进入中后期或存在既往感染。
图1. 免疫应答中特异性IgM、IgG抗体产生及变化的一般规律[6]
对于与2019-nCoV同属冠状病毒的SARS-CoV、MERS-CoV的特异性抗体出现时间，尽管各研究报道间存在差异，但其总体抗体变化规律与一般病毒感染存在相似性[7-9]。如王曙照等研究显示，IgM最早于发病第6天出现，阳性率高峰在病程2-3周，持续时间较短，多数只持续20-30天。IgG最早也在发病第6天出现，阳性率高峰在病程3-4周，部分患者3个月后IgG转阴[8]。而在对于14例SARS康复患者7年随访研究中显示，IgG水平逐年下降，7年后大部分患者IgG抗体滴度消失[10]。抗体的产生与疾病的严重程度相关，重症组SARS患者血清特异性抗体效价显著高于轻症组[11]。给SARS急性期病人输注了恢复期血清后, 患者的病情明显好转[12]，由此推测，SARS特异性IgG抗体是一种保护性抗体, IgG抗体的持续存在是获得病后免疫力的标志之一。
目前，新冠肺炎患者的体液免疫应答机制尚未完全明确，尚需进一步深入研究。2019-nCoV特异性IgM多在发病后3-5天出现阳性[13]。一项来自武汉抗疫一线的研究显示，COVID-19患者2019-nCoV IgM和IgG抗体检测的临床敏感度分别为70.24%和96.10%，具有较高检出率[14]。因此，对于新冠肺炎来说，特异性抗体检测可有助于早期辅助诊断，并且与单独IgM或IgG抗体检测相比，联合检测IgM和IgG有助于辅助不同感染阶段的患者的诊断评估。
二、新型冠状病毒抗体检测技术的特点
截至2020年3月6日，本次新型冠状病毒疫情中共有5款2019-nCoV抗体检测试剂盒通过国家药监局应急审批并取得注册证，分别基于胶体金法和化学发光免疫分析法。其他特异性抗体检测方法包括酶联免疫吸附法、荧光免疫层析法等。
1. 胶体金法
是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的免疫标记技术。胶体金法具有快速、操作便捷及结果准确可靠的特点，相比而言，其生产成本和检测成本均较低，操作人员不需经过专门技术培训，检测无特殊仪器设备，可单人份测定，且试剂稳定、易保存，结果重复性好，检测标本种类广泛，特别适用于急诊检验、现场检验、家庭检验及需要大面积推广的筛查项目的检验。首批通过国家药监局应急审批的两款试剂盒均基于胶体金法，也说明其在本次疫情防控中的特有技术优势。
以万孚生物新型冠状病毒抗体检测试剂盒（胶体金法）为例，其为基于胶体金免疫层析原理，应用捕获法，检测2019-nCoV感染患者血液样本中的2019-nCoV抗体（IgM/IgG）。检测原理如下：（1）受试者样本（如血清、血浆、全血）在检测条加样孔加入，通过毛细作用向前移动至结合垫处。（2）结合垫包含示踪剂（2019-nCoV重组抗原金标结合物和兔IgG金标结合物），样本中2019-nCoV IgM或IgG可与示踪剂相互反应形成复合物，再与兔IgG金标结合物移动至硝酸纤维素膜上固定的抗体区域（检测线、质控线）。（3）检测线区域包含抗人IgM（μ链）抗体和抗人IgG（γ链）抗体，质控线区域包被抗兔IgG抗体。兔IgG金标结合物可被抗兔IgG抗体捕获，在质控线（C线）处呈现红色条带，显示质控正常。2019-nCoV IgM或IgG与示踪剂的复合物，可被抗人IgM（μ链）或抗人IgG（γ链）抗体捕获，在测试线（T线）呈现红色条带，显示2019-nCoV抗体（IgM/IgG）阳性，15分钟即可肉眼判读。
图2. 基于胶体金法的新冠病毒抗体检测试剂原理图
2. 化学发光免疫分析法
是一种将高灵敏的光反应与高特异性的免疫学反应相结合，用光反应表现被测免疫成分浓度的方法。按照标记物不同分为三类[15]：化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析、电化学发光免疫分析。化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强等优点，并已较好的实现检测自动化，避免了手工操作的误差。
化学发光免疫分析技术，由免疫反应系统和化学发光分析系统组成，免疫反应系统是将化学发光物质直接标记在抗原或抗体上，经过特异性反应后，形成抗原-抗体复合物，然后用相应标记物的检测方法进行检测。化学发光分析系统是化学发光物质在催化剂的作用下氧化还原反应，由基态跃迁到激发态，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器光量子产率。
3. 酶联免疫吸附法
是以酶作为标记指示物，以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。ELISA具有准确性高、价格较低、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点。
基本原理为在保持抗原或抗体免疫活性的前提下，将其结合到固相载体表面，测定时把待测样本和酶标抗原或酶标抗体，按一定顺序与固相载体上的抗原或抗体反应，形成的免疫复合物存在于固相载体表面，免疫复合物中的酶量与样本中待检抗原或抗体的量成一定的比例，未结合的标记物游离液相中，用洗涤的方法去掉未结合的标记物和其他物质，加入底物后显色，根据酶对底物催化的显色反应程度，对标本中的抗体进行定性或定量测定。因操作步骤相对较多，各环节都可能对其检测效果产生影响，需保证符合要求的试剂和操作的标准化。
基于免疫标记技术的抗体检测本身具有灵敏度和特异性较好的技术特点，但也需关注对于技术本身的潜在影响因素。其中包括抗原因素（抗原异质性）、抗体因素（抗体异质性）、钩状效应（由于抗原、抗体浓度比例不合适而致检测结果呈假阴性的现象）及基质效应（样本中被检测物以外的组分，对检测物的检测过程有显著的干扰）等[16]。因此，对于COVID-19患者的辅助诊断，特异性抗体检测需要采用具有资质试剂和规范操作，对可能出现的异常及原因深入分析，并结合临床综合评估。
三、新型冠状病毒抗体检测在疫情防控中的应用
1. 抗体与核酸检测协同，促进患者检出率提升
鉴于2019-nCoV的高传染性，对患者进行“早发现、早诊断、早隔离、早治疗”是控制疫情蔓延的有力措施。疫情初始，核酸检测被推荐为新冠肺炎的主要确诊手段[17]。但在临床实践中，核酸检测可能受样本采集部位、采集方法、病程等因素的影响而出现假阴性结果[18]。且由于核酸检测对检测环境和人员的要求较高，也为疾控中心和医院带来很大挑战。国务院总理李克强曾表示：“要抓紧研制出检测时间更短、结果更准、操作更简便的试剂。”可见，建立快速、准确、简便、安全、有效的新冠病毒特异性检测方法十分紧迫。
2019-nCoV IgM和IgG抗体检测，可与核酸检测互补，提高新冠肺炎检出率。一项研究显示，在19例核酸检测阴性但基于临床症状诊断的新冠肺炎患者中，有16例患者IgM阳性，其阳性率达到84.21%；有18例患者IgG阳性，其阳性率达到94.74%[14] 。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》更新中，已将“新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG阳性”或“新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”增加为确诊条件之一，以及将“连续两次新型冠状病毒核酸检测阴性（采样时间至少间隔24小时），且发病7天后新型冠状病毒特异性抗体IgM和IgG仍为阴性”作为排除患者条件[13]。IgM和IgG在疾病的不同发展阶段具有不同的变化规律，通过IgM和IgG联合检测，可以实现从感染早期到恢复期的患者辅助诊断，更适合于实际诊疗中不同疾病阶段患者的就诊需求，有助于降低漏诊率。
2. 完善患者治疗监测及病程转归辅助评估
在机体初次接受抗原刺激后，抗体产生的过程可划分为若干阶段[6]：1）潜伏期：历时长短受机体状况、抗原性质及其进入机体的途径等因素影响，此期间体内不能检出抗体；2）对数期：抗体水平呈指数增长；3）平台期：抗体水平相对稳定，到达平台期所需时间及平台期的抗体水平和持续时间，依抗原不同而异；4）下降期：由于抗体被降解或抗原结合而被清除，体内抗体水平逐渐下降。特异性IgM、IgG的动态变化趋势与患者的疾病发展过程密切相关。患者感染2019-nCoV的早期，仅IgM能被检出；随着病程进展，IgM和IgG均检出阳性；IgG浓度升高，则预示患者逐步进入恢复期。目前COVID-19康复患者中存在一部分患者“复阳”现象引起广泛关注，即康复出院患者（2019-nCoV核酸检测阴性），但出院后复查核酸检测阳性。因此，在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》更新中，在患者出院后注意事项中将“应继续进行14天自我健康状况监测”改为“应继续进行14天的隔离管理和健康状况监测”，加强进一步管理。而IgG为保护性抗体，IgG的持续高表达也是病后具有长期免疫力的标志，已有医院将2019-nCoV抗体作为所有拟出院病人的必要检查。通过对于IgM和IgG的抗体水平变化趋势评估，可有助于完善对患者的治疗监测和病程转归评估。
3. 应对疫情爆发期间的快速排查及常见呼吸道感染疾病鉴别诊断需求
春季是流感高发季节，如甲型/乙型流感，临床上会出现发热、畏寒、乏力，血常规提示白细胞正常或偏低，重症流感胸部CT可出现磨玻璃阴影，这些临床特征容易与新冠肺炎混淆。正值复工回流高峰，可能存在大量疑似患者，亟需进行常见呼吸道感染疾病和新冠肺炎的鉴别。日前已有包括2019-nCoV在内的6项呼吸道病毒联合核酸检测产品获批上市。
抗体检测对检测环境和人员要求更为宽松，与核酸检测相互印证，可对疫情期间的大量疑似患者进行快速排查。此外，甲型流感、乙型流感等常见呼吸道病毒的抗原/抗体检测产品较为成熟，目前已广泛应用于各级医疗机构。因此，2019-nCoV抗体检测也可与常见呼吸道病毒免疫学检测联合应用，以应对疫情期间疑似患者的快速鉴别诊断需求。
综上所述，抗体检测对新冠肺炎的辅助诊断、鉴别诊断、治疗监测和病程转归等方面均具有应用价值。但同时抗体检测本身也存在局限。因此，需要合理看待及使用抗体检测。随着新冠病毒抗体检测试剂上市，相信在国家的引导与监管下，抗体检测能最大程度地助力新冠疫情防控。
参考文献
World Health Organization. Coronavirus disease 2019 (COVID-19) Situation Report-43.
《中国-世界卫生组织新型冠状病毒肺炎（COVID-19）联合考察报告》
Zhe Xu, Lei Shi, Yijin Wang,et al. Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome. The Lancet Respiratory Medicine (2020)
Xintian Xu, Ping Chen, Jingfang Wang, et al. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Science China Life Sciences, 2020
中国疾病预防控制中心新型冠状病毒肺炎应急响应机制流行病学组. 新型冠状病毒肺炎流行病学特征分析. 中华流行病学杂志, 2020, 41(2): 145-151
何维. 医学免疫学（第二版）. 北京：人民卫生出版社，2010
万卓越，张欣，鄢心革，等. 间接免疫荧光法在检测SARS冠状病毒特异性抗体中的应用. 华南预防医学. 2003, 29(3): 36-37.
王曙照，王健，檀玉芬等. SARS患者特异性SARS-CoV 抗体变化的观察. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004, 24
Corman VM，Albarrak AM , Omrani AS，et al. Viral Shedding and Antibody Response in 37 Patients With Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Infection. Clin Infect Dis. 2016 Feb 15;62(4):477-483.
石玉玲, 李林海, 孙朝晖, 等. SARS患者7年随访血清抗体变化规律及胃肠道免疫组化研究. 中华流行病学杂志．2010, 31(7): 795-799
梁艳, 匡铁吉, 刘金伟, 等. 特异性体液免疫与传染性非典型肺炎患者病情的关系研究. 中国免疫学杂志, 2004, 20(2): 100-101
Nie QH, Luo XD, Hui WL.Advances in clinical diagnosi s and t reatment of severe acute respiratory syndrome. World J Gast roenterol, 2003, 9 (6): 1139-1143 .
国家卫生健康委办公厅.《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》
[徐万洲，李娟，何晓云，等. 血清2019新型冠状病毒IgM和IgG抗体联合检测在新型冠状病毒感染中的诊断价值. 中华检验医学杂志, 2020
刘瑶，田亚平.免疫标记技术的现状和发展. 中华临床医师杂志(电子版) 2013,7(8)
吕世静，李会强.临床免疫学检验(第3版).中国医药科技出版社，2015
国家卫生健康委办公厅.《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》.
里进，叶光明，陈良君,等. 新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测假阴性结果原因分析及对策. 中华检验医学杂志, 2020, 43(00).
