胶体金免疫层析法在新型冠状病毒特异性抗体检测中的应用

李一荣，医学博士，主任技师、副教授、博士生导师，武汉大学中南医院检验科主任。兼任中华检验医学杂志编委、中国医疗保健国际交流促进会基层检验技术标准化分会副主任委员、湖北省医学检验分会副主任委员。先后主持国家重点研发计划课题、国家自然科学基金、湖北省自然科学基金课题多项。以第一作者或通讯作者发表论文40余篇，其中SCI收录30余篇。

【摘要】目的：探讨胶体金免疫层析法检测血清中新型冠状病毒（SARS-COV-2）特异性抗体的可行性。方法：采用胶体金免疫层析法检测212个血清样本中的SARS-COV-2特异性抗体，并计算检测的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确率。结果：新型冠状病毒肺炎（COVID-19）确诊组、康复组与健康献血组中SARS-COV-2特异性抗体的阳性率分别63.63%、87.80%和1.20%，康复组的阳性率显著高于确诊组（X2=7.98，p=0.005）；该方法检测的灵敏度为71.31%，特异性为98.80%，阳性预测值为98.92%，阴性预测值为68.91%，准确率82.07%；根据发病时长将确诊组样本分为＜8天组、8~15天组和＞15天组，＜8天组的阳性率显著低于8~15天组和＞15天组（X2=8.77，p=0.003；X2=7.66，p=0.006）；9个首次检测为阴性的患者，在2-9天后再次采血检测结果呈阳性。结论：胶体金免疫层析法是一种快速有效的检测血清中SARS-COV-2特异性抗体的方法，但阴性结果一定要结合患者的发病时长综合分析。

关键词：新型冠状病毒；新型冠状病毒肺炎；抗体；胶体金免疫层析

2019年底，一种新型冠状病毒（The severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-COV-2）首次在武汉出现，随后快速播散到全中国乃至全世界，具有较强的传染性与传播能力^【1】。SARS-COV-2引起新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease ，COVID-19），患者主要临床表现为中低热、干咳和乏力，少数患者可出现流涕、鼻塞、咽痛、肌痛与腹泻等^【2】。患者早期胸部CT显示肺部出现多发小斑片影及间质改变，可进展为双肺多发磨玻璃影、浸润影及肺实变^【3】。病原学诊断主要依据SARS-COV-2核酸检测，但不论是检测咽拭子、鼻咽拭子、血液、痰以及大便与尿液中的SARS-COV-2核酸，其阳性率均不尽如人意，因此迫切需要新的检测方法辅助COVID-19的诊断^【4-6】。本研究拟采用胶体金免疫层析方法检测血清中SARS-COV-2特异性抗体，用于评价其对COVID-19的诊断价值。

一、材料与方法

1. 病例

71例COVID-19确诊患者为武汉大学中南医院住院患者，满足COVID-19第七版的确诊病例的要求，其中男性36例，女性35例，年龄中位数56岁，年龄跨度20-96岁，其中55个患者检测1次SARS-COV-2，15个患者检测2次，1个患者检测3次，共采集了88例血液样本。41例COVID-19康复出院者，SARS-COV-2核酸检测阴性，其中男性18例，女性23例，年龄中位数51岁，年龄跨度29岁-93岁。每个患者采集静脉血5ml，置于红色试管中，室温放置2小时，3400rpm离心10min，吸取血清置于灭菌的EP管中，于-20℃保存。83例健康献血者的血清来自中部战区总医院输血科，血液样本采集日期在2019年12月31前，血清样本于-20℃保存。

2. 检测方法

（1）检测试剂与原理

SARS-COV-2特异性抗体检测试剂盒由广州万孚生物技术有限公司惠赠。该试剂盒采用胶体金免疫层析法检测SARS-COV-2特异性抗体。当患者血清中含有SARS-COV-2特异性抗体时，则抗体与金颗粒标记的抗原结合，形成SARS-COV-2特异性抗体-金颗粒标记的抗原复合物，复合物通过层析效应扩散到检测区，检测区包被的第二抗体就会与SARS-COV-2特异性抗体-金颗粒标记的抗原复合物结合，形成第二抗体-SARS-COV-2特异性抗体-金颗粒标记的抗原复合物，从而在检测区显色。

（2）检测步骤

将-20℃保存的血清室温解冻后，取10μl血清加入测试卡的加样孔中，随后向测试卡的稀释液加样孔加入80μl的样本稀释液，15分钟观察结果。当质控区与测试区均出现一条红色反应线时，表示SARS-COV-2特异性抗体阳性，而仅质控区出现一条红色反应线时，则表示SARS-COV-2特异性抗体阴性。

二、结 果

1. 胶体金免疫层析法检测血清中SARS-COV-2特异性抗体

采用胶体金免疫层析法对212个血清样本进行检测，COVID-19确诊组、康复组与健康献血组的SARS-COV-2特异性抗体阳性样本数分别为56（63.63%），36(87.80%)和1个（1.20%）。卡方检验显示COVID-19康复组中SARS-COV-2特异性抗体的阳性率显著高于确诊组（X2=7.98，p=0.005）。将COVID-19确诊与康复患者合并后，则该方法检测的灵敏度为71.31%，特异性为98.80%，阳性预测值为98.92%，阴性预测值为68.91%，准确度82.07%。

2. 发病时长对血清SARS-COV-2特异性抗体检测结果的影响

将88个来自COVID-19确诊患者的血清按照发病时长（发病到采样之间的时长）分为＜8天组，8~15天组和＞15天组，每组的阳性数及阳性率具体见表一。卡方检验显示三组的阳性率存在显著性差异（X2=12.08，p=0.002），＜8天组的阳性率显著低于8~15天组和＞15天组（X2=8.77，p=0.003；X2=7.66，p=0.006 ），但8~15天组和＞15天组的阳性率无显著性差异（X2=0.005，p=0.94）。

表1. 不同发病时长采血时血清中SARS-COV-2特异性抗体的检测结果

表2. 同一病人血清SARS-COV-2特异性抗体监测结果

3. 同一病人血清SARS-COV-2特异性抗体监测结果

共有16个病人在不同发病时期采集了2次或3次血液进行了SARS-COV-2特异性抗体的检测，其中7个患者前后两次结果均为阳性，而另外9个病人首次检测均为阴性，而后第2或第3次检测结果均变为阳性，具体结果见表2。

三、讨 论

SARS-COV-2为一种β类的新型冠状病毒，可通过呼吸道和消化道进行传播。其引起的COVID-19为乙类传染病，危害极大，因此早期快速诊断对于COVID-19的防控具有重要价值【1-3】。采用实时荧光RT-PCR法检测咽拭子等样本中SARS-COV-2的RNA是明确COVID-19病因的重要方法，但是该方法必须在标准化的PCR实验室中进行，而且病毒灭活如不充分可能会导致实验室播散并感染检测者【4-6】。另外由于采样等因素该方法具有一定的假阴性率，因此迫切需要建立新的方法用于COVID-19的病原学检测。

胶体金免疫层析技术是一种快速检测抗原或抗体的方法。该方法操作简单、结果容易判读，而且不需要特殊的仪器与设备，因此我们采用广州万孚生物技术有限公司生产的胶体金免疫层析试剂盒，分别对COVID-19的确诊者、康复者以及健康献血者血液中的SARS-COV-2特异性抗体进行检测。本研究之所以选择2019年12月31号前采集的献血员标本进行特异性实验，是因为担心疫情下的武汉，除了显性感染外，可能还有一定比例的隐性感染患者。研究结果显示COVID-19的确诊组、康复组和健康献血者组中血清SARS-COV-2特异性抗体的阳性率分别63.63%、87.80%和1.20%，将确诊组和康复组合并为研究组，则该方法检测的灵敏度71.31%，特异性为98.80%，阳性预测值为98.92%，阴性预测值为68.91%，准确度82.07%，提示采用胶体金免疫层析法检测血清中的SARS-COV-2特异性抗体具有较高的准确性与阳性预测值，但阴性结果的分析与判断应慎重。

为了明确阴性预测值偏低的原因，我们首先比较了COVID-19康复组与确诊组血清的SARS-COV-2特异性抗体的阳性率，结果显示康复组血清SARS-COV-2特异性抗体的阳性率显著高于确诊组，提示发病时长可能影响SARS-COV-2特异性抗体的检出率。随后我们将确诊组的样本按发病时长分为3组，即＜8天组、8~15天组和＞15天组，结果显示8~15天组和＞15天组的阳性率均高于＜8天组，进一步支持发病时长影响SARS-COV-2特异性抗体的检出率。我们还对16例COVID-19确诊患者血清的SARS-COV-2特异性抗体的检测结果进行了前后比较，9例首次阴性的患者在2-9天再次采血其SARS-COV-2特异性抗体呈现阳性。因此发病时间过短采血检测SARS-COV-2特异性抗体是导致胶体金免疫层析法阴性预测值偏低的重要原因。支持我们的观点，众多免疫学检测方法均存在窗口期，如采用ELISA或化学发光法检测SARS-COV特异性抗体，其窗口期多达8天，采用化学发光法检测抗HIV抗体，其窗口期更是多达11天【7-10】。

总之，胶体金免疫层析法是一种快速有效的检测血清中SARS-COV-2特异性抗体的方法，具有较高的准确性与阳性预测值，但阴性结果一定要结合患者的发病时长综合分析，发病早期采血检测SARS-COV-2特异性抗体容易出现阴性结果。

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