高危人乳头瘤病毒DNA电化学芯片 地磁检测试验

宫颈癌是世界第三大最常见发病的癌症类型和第四大女性致死性癌症类型。由于缺乏有效的筛查程序，宫颈癌让发展中国家承受巨大的压力。大部分女性发展为宫颈癌是因为高危人乳头瘤病毒（hrHPV）持续感染，2种致癌性最强的HPV类型-HPV-16和HPV-18是大约70%的宫颈肿瘤的元凶。HPV-16主要引发鳞状细胞癌，而HPV-18主要引发腺癌—一种不常见但更加具有侵袭性的癌症。但是，宫颈致癌作用会随着感染或共感染多种其他发挥协同作用的高危HPV亚型而加强。

Papanicolaou（Pap）涂片由于价格低廉、简单易用、副作用极低，成为主要的妇科筛查方法，且已经被使用了60多年。在过去的几十年中这种方法成功地降低了西方国家宫颈癌的总发病率和总死亡率。但是，最近一些国家的筛查研究表明Pap涂片方法结合HPV检验更有利于发现宫颈癌。因为HPV筛查在降低浸润性宫颈癌发病率方面的有效性比细胞学筛查方法要高60%-70%。最近2种常见HPV类型试验已经可以使用：一种试验可以检测高危HPV亚型，但不能指明是哪一种；另一种实验可以检测HPV-16和HPV-18是否存在。HPV试验基于检测下列内容（a）HPV DNA，例如Cobas 4800系统（Roche Molecular System）设计用于HPV-16、HPV-18和12中其他非特异性高危HPV亚型的特异性检测；FDA批准的HC2试验（Qiagen）则是核酸分子杂交试验，能定量检测13种hrHPV；（b）RNA试验，例如FDA批准的Aptima mRNA试验（Gen-Probe），可以鉴别14中高危HPV亚型的E6和E7 RNA。

鉴于HPV筛查的重要性，目前正在寻求新型的、更加廉价的而且更快的方法替代现有标准方法。而电化学（EC）检测则可以满足这些要求。此外，由于在小型化点击阵列和芯片上平行检测多个样品，电化学方法还能实现设备简单化。在过去的几年中，大量的文章对多种生物医学和肿瘤学，例如：突变基因、重复测序、病毒和细菌DNA、微核糖核酸（mRNA）等具有重要意义的核酸检测用EC试验和传感器进行了叙述。根据这种趋势，越来越多的关于HPV EC检测的文章正在出现，证明了EC检测的重要性以及话题吸引力。但是，并不是所有的EC检测都可以应用到患者样品，即从患者的宫颈涂片或采样刷上分离DNA，这是方法验证的一个重要方面。

在这篇文章中，我们论述了通过使用地高辛标记检测探针和抗地高辛抗体结合过氧物酶进行检测，转换底物到电活性产物上，使用磁性粒子方法和DNA捕获探针将EC试验与HPV目标序列分离相结合。在丝网印刷碳电极芯片上进行试验同时测量多个样品，获得了良好的再现性、灵敏度和选择性。该试验已经成功应用到DNA检测，不仅是癌症细胞系，还包括患者宫颈刷涂片样品。

链霉亲合素调整的磁性粒子（M-270）来自Invitrogen，磁性粒子浓缩器戴诺磁珠MPC-S，酪蛋白封闭液来自TheromFisher Scientific，地高辛（DIG）寡核苷酸3端标记试剂盒和抗地高辛过氧物酶Fab片段（抗DIG-HRP）来自Roche Diagnotics，对苯二酚生物素和链霉亲合素过氧物酶来自Sigma-Aldrich，PCR反应PPP混合物来自Top-Bio（Czech Republic）。全部其他试剂为分析级试剂。

DNA探针，HPV目标和引物由Generi Biotech（Czech Republic）合成，复溶于水，使用分光光度法测定其浓度。根据试剂盒说明书使用地高辛对检测探针进行标记，混合推荐数量的未经调节的检测探针、反应缓冲液、CoCl2溶液、DIG-DDUTP溶液和末端转移酶共100pmol，在37℃环境中培养15分钟，最后添加0.2M EDTA。

我们在快速实时PCR系统7900HT（Applied Biosystems）上使用MeltDoctor HRM MasterMix（ThermoFisher Scientific）执行高分辨率融合试验测定HPV DNA及其互补DNA探针形成双链体精确的融合温度。将融合曲线作为一阶导数标出，测定融合曲线上的拐点形成的峰值作为融合温度（Tm）值。

使用多用途稳压器/横流器uStat 8000（DropSens），使用8个配备直径2.56mm碳工作电极的3电极电化学电池构成的丝网印刷电化学阵列（DropSens）执行极谱电流时间曲线测量。反电极为碳制，假基准电极为银制。特殊设计的磁力架（DropSens）位于阵列下方，有助于磁性粒子集中在工作电极表面。

在升温到60℃时执行检测探针和目标HPV杂交30分钟，限制部分补充序列杂交改进特异性。杂交期间，使用清洗缓冲液（5mMTris-HCl，pH7.5，0.5mM EDTA，1M NaCl）清洗5ul链霉亲合素调节的磁性粒子3次，使用生物素化捕获探针在25℃的环境中培养15分钟。接着再次清洗3次。如果使用链霉亲合生物素检测系统，则使用1mM生物素培养粒子阻断其余链霉亲合素结合点。在使用地高辛-抗地高辛系统时，没有必要使用生物素阻断，粒子直接使用预杂交目标HPV/检测探针双链体在25℃的环境中培养30分钟，形成包括捕获探针、目标HPV和检测探针的“三明治”。经过3次以上的清洗后，抗DIG-HRP在酪蛋白封闭液中以1:1000比例稀释并添加到粒子中接着在25℃的环境中培养45分钟。再次清洗粒子，接着使用10ul 0.1M磷酸钠缓冲液，pH6.8重构。

10ul重构磁性粒子移液到磁性支架支持的工作电极表面，接着小心使用0.1M包含50nM对苯二酚和250nM过氧化氢的磷酸钠溶液覆盖所有电极。在-0.3V使用极谱电流时间曲线监测酶促氧化对苯二酚电解还原60秒，记录电流下降的稳定值。

在包含10%FBS（胎牛血清）、1%丙酮酸盐和1%青霉素链霉亲合素溶液的高汤DMEM（细胞培养基）中培养H1299和Hela癌症细胞系。在RPMI培养基中使用10%FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素链霉亲合素溶液培养CaSki和SiHa细胞。全部细胞在37℃，5%CO2的环境中培养。根据厂商说明使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒（Qiagen）从所有细胞系中分离DNA。

使用宫颈刷从来自布尔诺大学附属医院妇产科诊所接受预防性妇科检查的患者组和健康个体身上采集宫颈样品。和DNA类似，使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒从宫颈样品中提取DNA。

用导致扩增子结合序列捕获和检测探针的方法选择真样品HPV DNA PCR扩增引物。混合正反引物、PPP混合物（包含Taq DNA 聚合酶、核苷酸混合物和MgCl2）和模板DNA执行PCR反应，在94℃（变性作用）、55℃（退火）和72℃（延长）循环40次。使用PCR扩增子直接进行磁性粒子杂交，无需纯化。

在NCBI数据库中检索HPV-16和HPV-18全基因组序列。EMBL-EBI网站上的成对序列对齐工具用来比较2个基因组并形成最终的HPV目标设计和探针序列。我们已经选择了3种不同的目标HPV片段：2种来自HPV-16基因组的不同位置（110-mer来自核苷酸1753；140-mer来自核苷酸1961），另外一种片段来自HPV-18基因组（140-mer来自核苷酸2031）。目标序列HPV-15-1753更为普遍，与HPV-18的相似度较高。从这个意义上来说，DNA探针补充这个目标序列对HPV-16的特异性较低，但可以用于捕获高危HPV类型。另一方面，使用成对序列对齐工具时，HPV-16-1961和部分重叠区域的HPV-18-2031 140mer的相似度水平不超过75%。因此被选为HPV-16和HPV-18基因组之间可能的差别位点。

对于每个目标HPV片段，我们设计2个补充探针组合—生物素化捕获探针（CP）和检测探针（DP）。我们的检测方法依据一个双杂交步骤，即CP和目标HPV杂交以及不同区域的目标HPV与DP增加杂交（图1）。为了加快这一方法，我们同时和单独地（i）调整CP和磁性粒子；（ii）预杂交目标HPV与DP。之后，目标HPV/DP双链体引入CP调整的粒子进行第二次杂交，形成CP/目标HPV/DP“三明治”。

图1. 建议的试验方法。生物素化捕获探针粘到链霉亲合素覆盖的磁性粒子上与目标HPV DNA杂交。与其他区域目标DNA杂交的检测探针被DIG抗原标记，并被与HRP结合的抗体鉴别。HRP接着氧化对苯二酚（HQ）为对苯醌（BQ），在电极表面还原为HQ。利用电击下的磁性吸引粒子到表面，提高测量灵敏度。

检测方法有2种变化—一种需要生物素化检测探针（bio-DP）和链霉亲合素青霉素结合物，另一种使用地高辛标记的检测探针（DIG-DP）和抗地高辛抗体-过氧物酶结合物。最初我们使用第一种方法，这种方法在一些文献中有被提及。尽管这种方法不涉及抗体，但是粒子经CP调整后需要使用游离生物素的额外阻断步骤避免生物素化DP非特异性结合到粒子表面的空闲链霉亲合素位点。但是，链霉亲合素分子结合4种生物素分子会导致多重生物素化DP通过链霉亲合素过氧物酶结合物结合，引起信号减弱。在特定条件下，使用地高辛系统更有利，这已经在之前得到证明。在使用地高辛标记生物素时（未显示），我们的初步结果产生了较高的信噪比，因此地高辛标记检测探针被用来进行进一步的研究。

优化一些步骤来最大化阳性和阴性质控品的差异，即加大阳性质控品的电路下降幅度并减少与阴性质控品的非特异性结合。这主要包括测量期间磁性粒子量、杂交温度、封闭液、酶溶液或还原电位的优化。

一些参数基于我们先前发表的关于mRNA检测的工作，这些工作也是用磁性粒子杂交，包括捕获探针浓度、清洗液成分或杂交时间。使用优化的条件时，获得了良好的方法再现性（图2）。3个使用100pM HPV-16-1753目标的独立试验显示出绝佳的相对标准差（RSD）<2%。在使用来自细胞系或宫颈涂片的DNA时，这一RSD有所上升但通常不会超过15%。

不仅如此，我们比较了2步杂交法（目标DNA与DP预杂交，随后在磁性粒子上与CP杂交）和1步杂交法，即在同一试管中混合目标DNA、DP、CP以及磁性粒子。尽管1步杂交方法较快，但是信号密度和信噪比较差。原因是当我们将目标DNA和CP以及DP一起杂交时，存在一些游离未杂交生物素化CP与无目标DNA链霉亲合素磁性粒子结合的风险，降低磁性粒子与目标结合的效果。使用2步方法时，我们首先使用CP（洗去其余）完全覆盖磁性粒子，记着使用目标DNA样品（和DP预杂交让方法更快）完全饱和CP调整的粒子。因此，使用CP调整磁性粒子和与目标DNA杂交分别进行时可以获得更好的灵敏度。

图2. 100pMHPV-16-1753目标DNA（浅灰）和空白（无HPV目标，深灰）的三联安培计测量。主图：安培计曲线；插图：标绘的电流强度（柱状图），连同误差条（n=3）。

任何HPV检测试验的一个重要方面是区分多种HPV序列的能力。如3.1所述，我们选择了3种不同的目标HPV序列和3对探针检测这些目标。接着，我们制作所有3个目标的混合物并在这些混合物中检测探针的性能。对于每个探针组合，混合物要么包含要么不包含补充目标HPV（图.3）。如果混合物中存在补充目标（标为+），就能获得可观的信号；但是如不存在（标为-），只能感测到非补充目标和DNA探针组微不足道的“交叉杂交”，这表明在这种情况下杂交效果非常差。这对HPV-16-1961和HPV-18-2031目标非常重要，这与其在相应基因组中的位置密切相关，具有75%的序列相似度。目标和DIG-DP杂交时通过升温到60℃，我们能区分HPV-16-1961和HPV-18-2031目标，即两个目标仅与其补充探针杂交，但是交叉杂交发生的概率很低。此外，我们进一步检验了DNA探针的特异性，及其在H1299癌症细胞系中的总DNA含量，再次获得了对补充目标DNA的良好特异性。

图3. 3个不同10nMHPV目标序列DNA探针选择性确认。（+）代表存其他目标化合物内存在补充HPV目标；（-）表示化合物不包含补充目标。

不存在目标HPV时观测到的噪声很低，说明与抗体酶结合物的非特异性结合程度低，这大概因为使用的酪蛋白封闭液不同。在不使用这种封闭液时，噪声几乎增加4倍（未显示）。混合物内10nM目标HPV-16-1753、HPV-16-1961和HPV-18-2031的信噪比分别为172、98和126。HPV-16-1962目标DNA标准差较大的可能解释是商业芯片电极表面的变化所致。

图4描述的目标HPV-16-1753不同浓度的峰高，参考与补充DNA探针杂交时的值。可观测到的峰值高度增加范围是1pM~1pM左右（与50 attomoles或~1pg HPV-16-1753一致），峰值从空白平均值被超过3个SD划分。这表明我们的方法灵敏度良好，通过信号过氧物酶扩增并使用封闭液可实现。

图4. 捕获补充DNA探针时，HPV-16-1753浓度上电流强度依赖性。误差条为2联测量。

我们直接在癌症细胞系内检验了我们设计探针的效果。出于这一目的，我们使用HPV阳性细胞（CaSki和SiHa 为HPV-16阳性；Hela细胞为HPV-18阳性）取得的DNA，接着在温度上升到60℃时与HPV-16特异性DP-16-1753杂交。这一温度基于我们HRM的结果（未显示），即我们测定在相同条件下检测探针/目标双链体融合温度，用于在该芯片上测量前杂交的温度（HPV-16-1753、HPV-16-1961和HPV-18-2031的Tm分别为74℃、69℃和73℃。）

极谱电流时间曲线测量（图5B）显示HPV-16-阳性细胞系，CaSki和SiHa比Hela（包含HPV-18序列）或H1299（HPV-阴性）电流下降速度快。这些结果与使用琼脂糖凝胶观测到的PCR结果一致（图5A）。

图5. 癌症细胞系内试验的应用，使用HPV-16DNA探针。比较（A）琼脂糖凝胶电泳和（B）电极芯片显示出良好相关性。CaSki和SiHa细胞系为HPV-16阳性，其他细胞系为HPV-16阴性。

最终我们的检测系统应用到布尔诺大学附属医院的临床样品中。首先从4名HPV-16阳性和4名HPV-16阴性患者的宫颈刷上提取DNA，常规临床检查期间，使用INNO-LiPA HPV基因分型Extra Amp试剂盒（Fujirebio，Tokyo，Japan）在布尔诺大学附属医院内测定全部临床标本中是否存在HPV。接着，用我们实验室开发的特殊PCR确认样品并使用琼脂糖凝胶电泳目测，如图6所述。确认方法与EC结果相关性很强。PCR扩增后阳性样品1和4显示出最强的带，在芯片上生成最高的电流，阳性样品2和3电泳和电化学带较差。4份阴性样品没有相关性，生成的电路非常低。凝胶也显示出DNA梯状条带（GeneRuler 100bp），底带相当于100bp，带生成的带比底带高，到200bp DNA片段，这可以验证扩增子尺寸为正确的140bp。总之，我们的结果确认了新开发EC方法的未来适用性，便于检测临床实验室宫颈刷标本高危HPV或直接在妇科手术中检测HPV。我们相信我们工作的意义不仅仅是能将该方法应用于癌症细胞系和患者样品，显示出与标准方法的良好相关性，还在于利用8个电极的阵列平行检测大量样品（因此减少测量时间），还可以设计功能性DNA探针区分HPV-16和HPV-18。

图6. 宫颈刷分离DNA的检测。4份HPV-16阳性样品（pos1-pos4），4份HPV-16阴性样品（neg1-neg4）使用PCR扩增进行了比较，随后（A）琼脂糖凝胶电泳；和（B）电极芯片；显示出良好相关性。左侧柱：DNA梯形带（100bp GeneRuler）显示扩增子尺寸正确为140bp。

基于先前磁性粒子辅助DNA或RNA杂交的报告，我们旨在开发可用于真实系统的DNA检测EC试验。我们选择HPV检测基于如下原因：i）已经证明HPV DNA检测的灵敏度优于传统的细胞学检测；ii）如果在人群中HPV患病率筛查应用范围更广（为了查明具有发展为宫颈癌风险的女性；同时避免过度治疗）需要开发新的、快速的和廉价的方法；iii）尽管EC DNA检测近些年广受关注，每年出现大量与之相关的文章，但真正使用人体样品的主要试验仍然缺乏确认，也缺乏与标准方法的比较。我们的试验因此具有作为直接检测宫颈样品中hrHPV DNA有效工具的潜力，满足包括HPV宫颈癌筛查指南要求，具有Meijer等人定义的再现性和同等准确度。

未来的研究和下一步的探索将侧重于不仅仅检测hrHPV DNA。考虑到疾病发展为宫颈肿瘤很大程度上取决于综合hrHPV基因组E6和E7基因表达的增加，我们的方法在测定这两种关键mRNA编码E6和E7肿瘤蛋白（分别抑制p53和视网膜母细胞瘤蛋白）时会非常有用。直接检测这些mRNA会更加有效，这表明无论病毒是否处于活跃状态，只要转化过程中这两种基因变得过表达，就会最终导致向宫颈癌发展。因此我们的方法还可以作为短暂宫颈发育不良和潜在恶化病变的特异性辨别工具。

（摘自Biosensors and Bioelectronics，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：张凯

审校：王小茜