胰岛素自身抗体检测在1型糖尿病实验室诊断中的应用
作者：周密 杨永宏 夏福臻
在1970年通过间接免疫荧光法在冰冻胰腺切片中发现胰岛细胞抗体（ICA），并且于1974年在1型糖尿病患者血清中发现ICA，从而确定1型糖尿病是一种自身免疫性疾病。胰岛自身抗体（islet autoantibody，iAb）随之成为1型糖尿病实验室诊断的重要标志物，对1型糖尿病的诊断和鉴别诊断起到非常重要作用。
ICA的检测通常是采用胰岛细胞或其粗提液作为抗原，包括了很多靶分子，不能确定是哪一种特异性自身抗体，并且其灵敏度也相对较差。因此，目前很多临床实验室不再使用ICA进行常规诊断检测。目前，临床实验室检测的四种特性iAb包括：谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）、酪氨酸磷酸酶自身抗体（IA-2A）、锌转运蛋白8自身抗体（ZnT8A）和胰岛素自身抗体（IAA）。它们分别针对自身抗原是谷氨酸脱羧酶(GAD65)、胰岛素样酪氨酸磷酸酶-2（IA-2）、锌转运蛋白8（ZnT8）和胰岛素（Insulin）。IA-2和ZnT8存在于β细胞的分泌颗粒表面，胰岛素存在于分泌颗粒中，GAD65存在于突触样微泡的细胞质中。目前，以上四种iAb均有相应的诊断试剂盒，方法上采用ELISA、免疫印迹、化学发光等。实验室检测标准化工作越来越重要。其中胰岛自身抗体标准化计划（IASP）对iAb的检测起到了积极的评估和协调作用。
一、胰岛自身抗体（iAb）检测的临床应用
iAb检测主要用于1型糖尿病（T1D）的诊断。T1D是一种慢性自身免疫性疾病，患者免疫系统错误地攻击和破坏胰腺中产生胰岛素的细胞，最终导致胰岛素绝对缺乏症。在临床症状为T1D的患者中，一种或多种iAb的存在提示胰腺自身免疫[1]。
美国糖尿病协会（ADA）、青少年糖尿病研究基金会和美国内分泌学会在2015年发表了一份联合声明，描述了T1D的不同阶段，其中胰岛自身抗体的测量起着主要作用[2]。在T1D的第1阶段，患者血糖正常，无症状，但多个胰岛自身抗体呈阳性。T1D的第二阶段可出现多种自身抗体并开始有血糖异常，但仍然没有临床症状。在T1D的第3阶段，患者有典型的糖尿病症状，伴有血糖异常，确诊为T1D。
美国糖尿病协会每年发布的最新糖尿病诊疗标准建议使用胰岛自身抗体对T1D进行早期诊断[1]。在临床上，基于多种自身抗体的早期诊断有助于降低糖尿病酮症酸中毒的发生率，并降低T1D的发病率和死亡率。然而，尽管iAb测量在T1D诊断中临床应用，大约10%的患者在发病时检测不到iAb，这些患者被诊断为患有1b型糖尿病。在所有T1D患者中，约50%-80%在诊断时为GADA阳性，30%-70%为IA-2A阳性，50%-70%为ZnT8阳性，50%-90%为IAA阳性[3]，IAA阳性在低龄儿童中更为普遍。值得注意的是，IAA必须在开始使用胰岛素治疗的2周内进行测量。在2周之后，外源性胰岛素可能会产生抗体，对检测造成干扰。存在上述四种自身抗体之一即可诊断T1D[1]。因此，建议在可能的情况下测量所有四种iAb（GADA、IA-2A、ZnT8A、IAA），以准确诊断疾病并最大限度地提高检测自身免疫性糖尿病的敏感性。
除了用于T1D的诊断外，iAb检测通常可用来帮助区分T1D和2型糖尿病（T2D），以及检测更少见的糖尿病类型，如青少年起病的成人型糖尿病（MODY）。当年龄、青春期状态、性别、体重指数、糖化血红蛋白和家族史等临床和代谢指标不能帮助鉴别诊断时，其诊断必须依赖iAb。其中一种比较少见的糖尿病是成人隐性自身免疫性糖尿病（LADA），也称为1.5型糖尿病。在新近诊断的成人T2D病例中，约10%的患者对单一iAb呈阳性，主要是GADA。这些病程进展缓慢直至需要胰岛素的患者通常被诊断为LADA，认为是一种缓慢进展的自身免疫性T1D。出于同样的原因，在iAb测试中，接近30%的新诊断出T2D的青少年将显示出自身免疫的证据，GADA或IA-2A是最常见的。这些年轻的患者也可能是一种缓慢进展的自身免疫性T1D，因肥胖等临床特征被误诊。
二、胰岛自身抗体（iAb）检测的方法学
iAb检测经历了放射免疫、免疫印迹、酶联免疫、化学发光免疫等几个阶段。放射免疫具有很高的灵敏度，但因放射性污染问题，现在国内已经逐渐停止使用。免疫印迹膜条的优势在于同一根膜条上可以同时检测多种不同的iAb，但灵敏度比放免低很多，同时只能定性检测。酶联免疫虽然可以定量检测，但灵敏度比不上放射免疫。最近发展起来的化学发光免疫检测具有和放免相同的灵敏度，没有放射性污染，并且可以做到全自动、高通量，是iAb检测最先进的方法学。表一列举了iAb检测的常用方法学和主要厂家，其中深圳市亚辉龙生物科技公司在全球率先开发出化学发光iAb免疫检测试剂盒，为T1D的实验室诊断提供了良好的解决方案。
在过去的十年中，由于胰岛自身抗体标准化计划（IASP）的努力，iAb检测方法有了显著的改进[3]。IASP的目标是在全球范围内提高iAb的检测水平，并每年在国际自身免疫糖尿病学会年会上召开两次会议。美国佛罗里达大学的TrialNet胰岛细胞自身抗体核心实验室在美国国家卫生研究院（NIH）下属的美国糖尿病、消化和肾脏疾病研究所的支持下运行IASP。TrialNet（www.diabetestrialnet.org）是由NIH资助的一个临床预防试验网络，于20世纪90年代初启动。美国糖尿病学会诊疗标准建议对T1D患者的亲属每年监测iAb，其阳性的个体有资格通过TrialNet进行临床研究试验，目的是预防T1D的发生并保留剩余的β细胞质量。
IASP的评估研讨显示，GADA、IA-2A、ZnT8A三种自身抗体在全球不同方法学中有着比较一致的表现，但IAA分析显示了实验室之间相对较大的差异，并且还没有达到令人满意的灵敏度和特异性水平。深圳市亚辉龙生物科技公司于2018年参加了IASP的评估计划及研讨[4]，GADA、IA-2A、ZnT8A三种化学发光试剂呈现出非常优异的临床灵敏度和临床特异性（见表二），得到了全球自身免疫糖尿病领域专家的一致好评。因为化学发光检测优良的灵敏度和特异性，并且全自动、高通量，iAb化学发光检测正在逐渐替代传统的放射免疫、免疫印迹和酶联免疫，必将成为未来iAb检测的主流方法。
三、T1D的早期诊断
通过测量iAb，实验室有能力在患者出现临床症状前的数年就确定T1D。2015年，青少年糖尿病研究基金会、美国内分泌学会和美国糖尿病协会发表了一份联合科学声明，建议在该病的任何表现之前确定T1D[5]。在建议的分期中，T1D的第1阶段发生在血糖正常、无症状的人有两个或两个以上iAb时。在T1D的第二阶段，有多个iAb的个体开始出现血糖异常。iAb和血糖异常患者在出现糖尿病临床症状时进入T1D的第3阶段。两种或两种以上iAb的存在使T1D在10年内发展的风险接近70%，随着时间的推移，这一风险接近100%。从血清转化到T1D的进展速度差异很大，从几个月到十几年不等。在有单一iAb的儿童中，15%在10年内进展为临床T1D。在这些儿童中，约有70%会在其血清中首次出现iAb后的2年内出现多种iAb。在从血清出现iAb阳性的10年内，有3个或3个以上iAb的患者中，有近75%发展为临床T1D。虽然血清转化年龄越小，自身抗体阳性率越高，IAA和IA-2A水平越高，进展到T1D的速度越快[6,7]，但对进展速度相关的因素了解甚少。
在早期阶段识别T1D是至关重要的。T1D的发病率随着时间的推移而增加。T1D的发病率在过去十年中增加了约3%-5%，预计每300名儿童中就有1名会患这种疾病。近90%的被诊断为T1D的患者家中没有T1D患者，直到病情危重时才意识到患有T1D。在T1D发病时，有40%的儿童因糖尿病酮症酸中毒而住院，酮症酸中毒有时会导致危及生命的脑水肿。前瞻性研究表明，随着时间的推移，对高危儿童进行iAb监测可大大降低诊断时酮症酸中毒的发生率。
四、T1D的筛查
既然iAb检测提供了在临床前阶段识别T1D并避免酮症酸中毒的能力，非常有必要对一般人群进行iAb的筛查以判断是否有自身免疫性糖尿病。一般人群iAb筛查目前正在国外一些大型临床研究项目中进行，其目标是改变防护标准，将常规iAb检测纳入儿科人群。虽然自1985年以来一直在进行关于一般人群筛查iAb的临床研究，但研究的范围相对较小，主要是在学校中进行的，并没有包括所有四种主要的iAb。2015年，德国巴伐利亚州启动了一个10万名的儿童iAb筛查项目，检测GAD、IA-2A、IAA和ZnT8A。在前10个月，该研究平均每月筛查2676名儿童，表明通过与儿保医生的合作，在普通儿童中筛查iAb的可行性[8]。
随着对iAb检测临床价值的认可，未来iAb可能会成为儿童体检的常规指标，因此需要高性能全自动的检测方法用于儿童广泛筛查。继续通过IASP增加检测的敏感性和特异性仍然很重要。化学发光免疫检测是具有高灵敏度和高特异性的全自动免疫分析系统，不使用放射性物质，是未来iAb实验室检测的最佳手段，必将为1型糖尿病的诊断、鉴别诊断以及一般人群筛查发挥巨大的作用。
结 论
50年前发现iAb奠定了T1D是一种自身免疫性疾病，iAb的检测保证在全球范围内对大量T1D患者的诊断和治疗。现在可以通过测量iAb来预测T1D，这有望降低与该病发病相关的发病率和死亡率。随着常规的iAb检测在儿童人群中应用，全自动化学发光免疫分析将会成为iAb实验室检测的主导方法。
参考文献
American Diabetes Association， Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2020. Diabetes Care. 2020 Jan;43 (Suppl 1): S14-S31
Hummel K, McFann KK, Realsen J, et al. The increasing onset of type 1 diabetes in children. J Pediatr 2012;161:652-7 e1.
Schlosser M, Mueller PW, Torn C, et al. Participating L. Diabetes antibody standardization program: Evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia 2010;53:2611-20.
Lampasona V, Pittman DL, Williams AJ et al. Islet Autoantibody Standardization Program 2018 Workshop: Interlaboratory Comparison of Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibody Assay Performance. Clin Chem , 65 (9): 1141-1152
Insel RA, Dunne JL, Atkinson MA, et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: A scientific statement of jdrf, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care 2015;38:1964-74.
Ziegler AG, Rewers M, Simell O, et al. Seroconversion to multiple islet autoantibodies and risk of progression to diabetes in children. JAMA 2013;309:2473-9.
Steck AK, Johnson K, Barriga KJ, et al. Age of islet autoantibody appearance and mean levels of insulin, but not GAD or IA-2 autoantibodies, predict age of diagnosis of type 1 diabetes: Diabetes autoimmunity study in the young. Diabetes Care 2011;34:1397-9.
Raab J, Haupt F, Scholz M, et al. Capillary blood islet autoantibody screening for identifying pre-type 1 diabetes in the general population: Design and initial results of the Fr1Da study. BMJ Open 2016;6:e011144.
