脂质组学检测技术及其临床应用价值
作者：路晓茅 邸埠生
单位：天津第三中心医院内分泌科
组学的概念兴起于上世纪，是指从整体的角度出发对组织细胞结构、基因、蛋白及其分子间的相互作用进行研究，通过整体分析反映生物体组织器官功能和代谢状态的一门学科，随着科学技术的发展，已先后涌现出诸如基因组学（genomics）、转录组学（transcriptomics）、代谢组学（metabonomics）等分支。脂质组学（lipidomics）的概念于2003年首次被提出，主要指通过技术手段对生物体、组织或者细胞内部的整体脂质成分及与其存在相互作用的分子和基因的表达进行系统性分析，通过不同状态下脂质代谢及其代谢的调控的比较，了解脂质的结构及功能，识别关键的脂质标志物，从而揭示脂质在代谢网络中的作用机制。其方法主要是通过应用有机溶剂对实验标本进行萃取，再经过漩涡震荡、超声、离心等处理过程，将脂质从标本中分离出来，再经色谱法或色谱-质谱联用等技术方法进行脂质分析及鉴定，最后通过计算机软件对检测获得的数据进行分析处理，从而找出有意义的脂质或衍生物，得出结论。根据2003年美国“脂质代谢途径研究计划”，目前脂质被分为八大类：脂肪酸类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、固醇酯类、孕烯醇酮脂类、多聚乙烯类和糖脂类[1]。本文就目前脂质组学技术的进展做一综述，并附一非酒精性脂肪性肝病病例的脂质组学检验进行说明。
一、脂质组学的研究技术进展
脂质的提取分离，脂质分析及相应的生物信息学技术是脂质组学技术的主要内容，其中脂质分析是非常重要的组成部分，为研究结果提供原始数据。目前已有多种技术方法应用脂质分析中，包括色谱、质谱、核磁共振等等，核磁共振法由于仅能用于组织中含量较高的脂质检测，且灵敏度偏低，多用于疾病检测中。随着脂质组学的发展，质谱技术逐渐成为脂质分析的主要工具。
1. 色谱技术：薄层色谱法（TLC）是最早应用于脂质检测的方法，又称纸色谱法，利用实验样品溶剂流过吸附剂时，样品中不同成分对吸附剂的吸附能力不同，达到分离各个组分的目的。脂质成分展开后，可采用薄层色谱扫描仪进行脂质定量测定，或刮下脂质斑点后进行测定。也有研究者在TLC法初步分离处理过脂质后加用气相色谱（gas chromatography，GC）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）或更高级的检测仪器及方法做进一步分析[2]。2010年，Roldan[3]等应用TLC及光谱法评价腹腔镜手术治疗胆石症患者时取下的肝组织的脂质含量，发现肝脏脂肪谱与脂肪含量显著相关。
应用气相色谱（GC）进行脂质组学研究略逊于薄层色谱和液相色谱。由于部分脂质分子属于不挥发性的物质，部分种类受热后容易降解，故而在分析前需进行预处理。分析不挥发的脂质分子前，需要将待检物质进行水解，再将水解后所得的皂化、非皂化部分以及游离脂肪酸等产物进一步甲酯化或三甲硅烷基化，提高脂质挥发性后方可进行检验[4]。但这些衍生化步骤会造成脂质结构信息的丧失，不利于脂质成分的检出，如：在应用气相色谱分离脂肪酸时，酯化的部分脂肪酸链（脂质的sn-1、sn-2酰基位）位点信息会丢失。由于气相色谱分析对异构体的敏感性高、分离能力较强，并能灵敏地检测出脂肪酸、磷脂、鞘脂、胆固醇和甘油酯等多种脂质成分，故而在脂质组学研究中，它仍是十分有利便捷的分析工具。
2. 液相色谱（liquid chromatography, LC）：对样品的挥发性没有要求，因此，无需进行衍生化步骤，故而不会造成脂质信息的丢失。在检测过程中，一般有正相色谱（NPLC）和反相色谱（RPLC）两种分离方法。NPLC应用疏水溶性溶剂作为流动相，对极性脂质的溶解性低。RPLC的流动相中水相所占比例较高，不易溶解非极性脂质；强极性和水溶性的脂质在检测过程中由于保留时间短、分离度低而不利于检测。此外，RPLC是根据辨识脂质碳链的长度及饱和度来分离脂质，脂质类内物质的分离效果较好，难以进行脂质类间区分。
近年来另一种新型的色谱分离模式——亲水作用色谱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）受到越来越多的关注。它应用未键合的硅胶极性固定相和水-水溶性有机溶剂作为流动相，分离机制介于正相色谱和反相色谱之间，与液相色谱相比可以更好地对极性脂质进行分离，有利于脂质的类内分离。同时，其高浓度的有机流动相有利于增强脂质离子化，提高检测灵敏度，且与液相色谱相比，亲水作用色谱与质谱的兼容性更好。
由于应用传统色谱法进行脂质组学检验时存在灵敏度和选择性欠佳的问题，目前多将色谱与质谱仪（mass spectrometer）连接，以提高检验灵敏度。
3. 质谱技术：质谱仪是分离并称量离子质量的仪器，核心是离子源，质量分析器和离子检测器。其工作原理是待分析样品通过离子源时，因带电性质不同，被电离成各种不同质荷比（m/e）的离子和碎片离子，然后使带有样品信息的离子加速进入质量分析器，根据不同质量的带电离子在电场或磁场中运动发生偏转不同的特性，将不同离子按质荷比不同分离并依次进入检测器，记录所得的离子质量谱即为质谱，第一台质谱仪于1912年问世。近百年来，质谱技术也在不断完善，同时质谱与色谱联用的方法也越来越多地应用于物质检测中。
4. 气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）：是应用较早的脂质检测方法，它同时具备了气相色谱的高分离效能和质谱仪的鉴定分子结构及定性定量的特点。应用该方法进行分析时，将质谱仪（MS）作为GC的检测仪连接在GC上，可以显著提高检验灵敏度。由于气相色谱对比于液相色谱（liquid chromatography，LC）的局限性，故而GC-MS法更多用于进行脂肪酸的分析。Shen[5]等人在2013年还应用GC-MS法测试小鼠的血浆标本，认为GC-MS法对于样本体内甘油的检测是可靠的。
在质谱发展史的早期，主要是应用电子轰击电离源作为离子源，这种方法限制待检样品需要具有一定挥发性并容易产生较多离子碎片方能进行检测。Dole[6]等于1968年首次提出了应用电喷雾产生气相离子的方法，于1973年提出将电喷雾与质谱技术联用，到1984年电喷雾离子源得以正式用于实验中。电喷雾离子化法（ESI）是将含有分析物的洗脱液施加电场使其带有电荷，同时给予辅助气流，使喷出带电液滴呈雾状，加热使溶剂蒸发，最后形成气相离子。由于过程中没有直接作用于分子的外界能量，因此对分子结构的丢失和破坏较少，是目前应用较多的电离法。1989年，Fenn[7]等首次将电喷雾电离质谱（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）技术用于分析大型复杂分子。Dos[8]等人应用ESI-MS法分析标准饮食、高脂饮食和高脂合并摄入橄榄油饮食的小鼠肝脏，发现增加橄榄油摄入的高脂饮食组的小鼠肝脏NASH程度低于单纯高脂饮食组，初步证明了在NASH中，橄榄油摄入可以作为一项潜在的饮食治疗方法。2005年，Han[9]等人在ESI电离技术的基础上又开发了鸟枪法（shotgun）：根据在不同pH值环境下，待检样品中脂质成分带电倾向不同的特性，通过调整样品的pH值，改变脂质分子离子化倾向，同时调整ESI正负离子检测模式，达到在离子化过程中即将不同脂质分子区分开的目的，目前这种“源内分离”（intrasource separation）串联质谱的技术方式已经成为脂质组学研究中较常用的方法之一。Skorve[10]等人利用鸟枪法检测高脂饮食、高脂及鱼油或磷虾油摄入饮食处理小鼠的肝脏及大脑，发现在鱼油及磷虾油摄入的小鼠肝脏中，一些与炎症和胰岛素抵抗相关的脂类存在明显差异，认为磷虾油比鱼油抗炎和增加胰岛素敏感性的作用更强。
在ESI-MS的基础上，1997年Brügger[11]等人又开发了电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）的方法分析脂质成分。ESI-MS/MS法是将同一脂质在质谱仪中诱导碰撞后解离并产生具有相同极性头基特征的碎片，根据这些特征碎片带电荷的不同，选用不同的扫描方式对这些特征碎片的前体离子进行扫描从而获得此类脂质的全部不同分子谱图。Yang[12]应用ESI-MS法对LDL受体基因敲除的小鼠肝脏进行分析，发现高脂肪高胆固醇的饮食与血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及甘油三酯有关。
随着联用技术的发展，液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）的分析方法受到越来越多的重视。它是将液相色谱和质谱仪联用，保留了质谱的高灵敏度和分辨能力，同时液相色谱对分析物的限制要求更低，已广泛应用到生物、化工、医药等多个领域。高效液相色谱（HPLC）的分辨率更高，分析速度更快，在分析大分子、极性较强、热稳定性差、高沸点的化合物时具有很大优势，HPLC-MS联用的分析方法能够提供可靠、精确的相对分子结构及质量，分辨率、灵敏度及特异性均较高。超高效液相色谱（UPLC）则是在高效液相色谱基础上由固定相装填颗粒粒径小于2µm的色谱柱、以及适应其速度和性能的高压溶剂输出、更高速的自动进样器、检测器以及数据采集控制系统，还有可以承受更高压力的低死体积色谱系统共同组成的，具有更高的灵敏度、分离度和分析速度，在与质谱仪联用时，更有利于物质的离子化，降低基质效应，提高质谱仪的灵敏度和重现性。
基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是将待检的样品（多为组织切片标本）与固态基质相混合，形成共结晶，然后晶体进入质谱仪的真空管，被一强激光激发，结晶吸收能量后升华，检测样品形成的气体充满真空室后，在强电场的作用下获得动能，根据荷质比的不同在真空管中飞行最后按不同时间到达检测器进行检测，由于其灵敏度更高、受干扰更小，逐渐成为进行脂质组学研究的有力工具之一。
二、非酒精性脂肪性肝病典型病例
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的疾病谱包括有非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、以及与其相关的肝硬化和肝细胞癌，其与胰岛素抵抗（IR）及遗传易感性密切相关，病理学改变与酒精性肝病（ALD）相类似，但患者没有长期过量饮酒史并除外其他明确原因导致的肝损伤[13]。
该病例患者女性，61岁，既往高血压、脑梗塞史。因“发现血糖升高1年”以糖尿病收入院。入院后检查：TG、TC正常范围，HDL-C：1.01mmol/L，LDL-C：2.08mmol/L，AST：75U/L，糖化血红蛋白：7.9%，肝炎全项及肝病自身抗体回报均阴性。腹部B超：中度脂肪肝。肝活检：符合脂肪性肝炎（S2A3F1），肝活检病理图片如下：
采集患者晨起空腹肘正中静脉血清标本，于室温放置2小时后离心取上清液为血清。取血清标本100μL，加入异丙醇提取液900μL漩涡震荡并超声处理后，置于-20℃的冰箱中冷冻1小时以上后取出，在室温下再次漩涡震荡后，在4℃的环境温度下，以冷冻离心机将标本再次离心处理，取上清液于-20℃冰箱中保存待检。
血清标本经异丙醇预处理后待用，以100%异丙醇为空白对照组。按空白对照样品、患者血清样品的顺序进行检测。UPLC-MS/MS法对样品进行分析：超高效液相色谱（ACQUITY UPLC I-Class系统；Waters公司），色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC系列（填充种类：CSH C18，填料粒径：1.7µm，孔径：130Å，规格：1mm×50mm，1/pkg；Waters公司）；柱温：50℃；样品室温度：10℃；流速：0.4mL/min；流动相：A：乙腈/H2O（60%/40%），B：异丙醇/乙腈（90%/10%），（A、B相均含有10mM的甲酸铵和0.1%甲酸）。电喷雾-四级杆飞行时间质谱（Xevo G2-S Q-TOF；Waters公司），质谱条件：离子源：电喷雾电离源（ESI），正负离子模式各采集一次；毛细管电压：3KV；锥孔电压：25V；碰撞能：15-60V；源温度：120℃；脱溶剂温度：500℃；锥孔气体速度：50L/h；脱溶剂气体速度：800L/h；扫描时间：0.2s；使用亮氨酸脑啡肽（m/z正离子：556.2771；负离子：554.2615）进行实时校正；使用甲酸钠进行校正（见图2）。
本次实验通过非靶向的脂质组学分析共检测到2943个可定量的峰，去掉0值和假阳性的结果，最后鉴定了792个脂质，主要是磷脂和甘油酯。
当病例足够多时，可根据实验设计的不同分组，应用专业软件将原始数据“降维”，进行主成分（PCA）分析并建立正交偏最小二乘分析（OPLSDA）模型，根据OPLS-DA模型的变量权重值VIP＞1筛选血清中浓度有显著变化的脂质成分并进行统计学检验，选取P＜0.05且VIP＞1的物质做为组间差异性脂质成分。
在我们的实验设计中，该病例隶属于2型糖尿病合并NASH组，与NAFL组对比，最终发现26个脂质成分存在差异。图3为此26个差异性脂质成分热图（见图3）。
三、讨论与分析
在脂质组学研究中，技术手段是非常重要的一部分，关乎实验是否能够成功。早期的薄层色谱法虽然操作简单、成本低，但灵敏度及分辨率偏低，脂质成分显色容易受到外界影响，脂质结构容易遭到破坏，且预处理过程繁琐，样品需要量较大。气相色谱分析预处理过程同样繁琐、耗时长，需要样品量大，且容易造成样品性状改变，从而影响位点信息的完整性，在应用上受限制。液相色谱技术简化了预处理过程，同时不会造成信息的丢失，但正相液谱对极性脂质的分离偏低，反相色谱则不利于非极性和强极性脂类检测。由于这些传统色谱分析方法在灵敏度和选择性上存在局限性，目前已很少单独应用。
早期的质谱检测由于电离源是加用外源性的能量，对待检样品的要求较高。改进应用电喷雾离子化法作为电离源后，由于没有直接作用于分子的外界能量，因此，对分子结构的丢失和破坏较少，提高了检验能效。鸟枪法的源内分离方式，使在离子化过程中即达到将不同脂质分子区分开的目的，具有样品用量少、预处理简单、分析时间短的优势，但对于一些低丰度脂质的检出存在一定限制。而ESI-MS/MS法的分析过程更加依赖碰撞能量的大小及脂质的分子结构组成，但它同时具有消除基线噪音，分析过程相对简单、谱图结果的信息针对性强等优点。
而随着科技的发展，当下脂质组学的研究中更多将色谱与质谱仪串联，从而达到提高检验灵敏度的目的。GC-MS法相比于LC-MS更多用于进行脂肪酸的分析，在复杂的脂质检测中其应用受限。LC-MS分析法具有对分析物限制低、同时灵敏度及分辨力较高的优点，越来越多地应用于化合物的分离和鉴定。而UPLC具有更高的灵敏度、分离度和分析速度，并可提高质谱仪的灵敏度和重现性，是目前最常应用的检测手段之一。 此外，MALDI-TOF-MS灵敏度更高、受干扰更小，具有更好的应用前景。
脂质组学作为一个新兴的学科，近年来开始引起人们的普遍关注，我们期待随着研究手段的飞速发展，脂质组学技术可以更广泛地应用于人们对脂质本身及其相应的功能、代谢过程、信号传导及调控等的研究，最终形成网络性、规模化的学术理论系统，从而更好地为人类服务。
参考文献
Baumruker T，Bornancin F，Billich A. The role of sphingosine and ceramide kinases in inflammatory responses[J]. Immunol Lett，2005，96(2)：175-85.
Peterson BL, Cummings BS. A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples[J]. Biomed Chromatogr, 2006, 20(3): 227-43.
Roldan-Valadez E, Favila R, Martínez-López M. In vivo 3T spectroscopic quantification of liver fat content in nonalcoholic fatty liver disease:Correlation with biochemical method and morphometry[J]. J Hepatol, 2010, 53(4): 732-7.
Peterson BL, Cummings BS. A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples[J]. Biomed Chromatogr, 2006, 20(3): 227-43.
Shen Y, Xu Z. An improved GC-MS method in determining glycerol in different types of biological samples[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2013, 930: 36-40.
Dole M, Mack L L, Hines R L, et al. Molecular beams of macroions[J]. The Journal of Chemical Physics, 1968, 49(5): 2240-2249.
Fenn JB, Mann M, Meng CK, et al. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules[J]. Science, 1989, 246(4926): 64-71．
Dos Santos GA, Ferreira MS, de Oliveira DN, et al. Identification of compounds from high-fat and extra virgin olive oil-supplemented diets in whole mouse liver extracts and isolated mitochondria using mass spectrometry[J]. J Mass Spectrom, 2015, 50(7): 951-8.
Han X, Gross RW. Shotgun lipidomics: electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples[J]. Mass Spectrom Rev, 2005, 24(3): 367-412.
Skorve J, Hilvo M, Vihervaara T, et al. Fish oil and krill oil differentially modify the liver and brain lipidome when fed to mice[J]. Lipids Health Dis, 2015, 11（14）: 88.
Brügger B, Erben G, Sandhoff R, et al. Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997, 94(6): 2339-44.
Yang L, Bennett R, Strum J, et al. Screening phosphatidylcholine biomarkers in mouse liver extracts from a hypercholesterolemia study using ESI-MS and chemometrics[J]. Anal Bioanal Chem, 2009, 393(2): 643-54.
中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组。非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版).中华肝脏病杂志，2010，18：163-166．
