非小细胞肺癌分子标志物检测方法及最新进展

作者：许江兵  王东亮  薛卫成

单位：北京大学肿瘤医院

近年来，随着靶向及免疫治疗药物临床研究的不断开展和成功，非小细胞肺癌的临床治疗手段也得到了突飞猛进的进展，已进入慢性病阶段。不过，近年间非小细胞肺癌领域的进展主要都体现在精准医学范畴，即基于各类分子标志物来筛选靶向或免疫治疗的获益人群是患者应用这些药物的前提和基础，只有精准的诊断和检测才能实现临床的精准治疗，这也促使肿瘤的检测方法不断发展和进步，以满足不断发展的肺癌临床诊疗需求，因此，通过多种分子病理检测方法来检测肺癌样本中的基因变异，更好选择潜在有效的靶向治疗或免疫治疗方案，以及避免不太可能带来临床获益的治疗方案非常重要。

一、肺癌分子病理检测方法进展

目前，肺癌临床实践中常用的分子病理检测方法有传统的检测方法免疫组化（IHC）、原位杂交（FISH）、聚合酶链式反应（PCR）和新型的高通量基因测序（NGS）多基因检测方法，各种分子病理检测方法有各自的优势和劣势（表1），肺癌的分子病理检测方法已从传统的检测方法（IHC、FISH、RT-PCR）发展到高通量基因检测技术（NGS)的阶段^【1】。NGS多基因检测方法比传统的分子病理检测方法有着较大的优势：（1）基于捕获的NGS方法能覆盖基因的全外显子，除可以检测常见热点突变，还能检测罕见突变和未知变异；（2）NGS多基因检测可仅需一份样本一次性同时进行多基因、多位点、多种变异的检测，可以节约时间、节约检测成本与样本用量；（3）NGS多基因检测可明确区分具体的突变类型和共突变情况，为患者提供更精准的用药信息指导。

从2016年开始，美国已批准三个NGS小Panel上市，分别覆盖卵巢癌、非小细胞肺癌和结直肠癌，以指导临床靶向治疗方案。目前NGS多基因检测方法已从小Panel发展到大Panel，NGS大Panel一般都包含几百个基因，具备以下特点：覆盖的癌种类型广，涵盖与肿瘤诊断、治疗和预后的相关基因及其变异形式多，能为临床的肿瘤诊治提供更多更全更有意义的信息；肿瘤免疫治疗发展至今，已成为最有效的临床治疗方法之一，但免疫治疗并非适用于所有患者，在未经筛选的患者中，免疫治疗的有效率仅约20%^【2-4】，NGS大Panel可以检测TMB、MSI等跨癌种免疫治疗标志物，再联合其他标志物如PD-L1，可有效筛选出免疫治疗的获益人群。

从2017年至今，美国FDA已批准四款NGS大Panel上市：（1）MSK-IMPACT，该方法能够快速检测肿瘤组织中的468个基因的体细胞突变、插入、缺失、拷贝数突变以及微卫星不稳定性（MSI）等其他分子标志物变化；（2）FoundationOne CDx，能对所有实体类型肿瘤进行伴随诊断，覆盖324个基因的遗传突变以及基因组变异，可以高效检测基因的单核苷酸位点变异（SNV）、插入缺失突变（Indel）、MSI以及肿瘤突变负荷（TMB）等；（3）2019年11年，FDA批准第一个全外显子组测序平台的检测产品Omics Core上市，可检测肿瘤组织中的总体肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden，TMB）以及468个癌症相关基因的体细胞突变；（4）2020年4月24日，美国FDA又批准了一款肿瘤NGS大panel产品 PGDx Elio Tissue Complete 的510(K)上市申请，该产品可同时检测507个基因的体细胞变异，包括MSI和TMB。

截至目前，国内已批准九款NGS平台的肿瘤小Panel试剂盒产品上市，覆盖的肿瘤类型分别是肺癌、结直癌和卵巢癌，适应症是指导临床靶向药的使用，但国内尚未批准任何一款基于NGS平台的大Panel产品上市。临床实践中面对多种分子病理检测方法，需要结合具体的临床需求和场景，来针对性采用不同的分子病理检测方法，最终为患者带来更好的临床治疗方案指导和获益。

二、肺癌分子病理检测标志物进展

晚期或转移性NSCLC基于驱动基因突变以及PD-L1表达水平的检测结果，可将晚期转移性肺癌患者分为三组，分别为：（1）驱动基因阳性；（2）PD-L1≥1%且EGFR，ALK，ROS1，BRAF，MET，RET阴性；（3）PD-L1＜1%且EGFR，ALK，ROS1，BRAF，MET，RET阴性。根据不同的分子病理检测结果，对应地分别采用不同的临床治疗方案（表2），从而实现晚期或转移性NSCLC患者的临床精准治疗。

1. EGFR：EGFR（表皮生长因子受体）是一种受体酪氨酸激酶，在上皮细胞表面发现并经常在各种人类恶性肿瘤中过表达。EGFR中最常见的突变（19外显子缺失，21外显子p.L858R点突变）对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗响应； 研究表明，不具有EGFR敏感突变的肺癌，在任何治疗线数时均不应使用EGFR TKI治疗^【5】。EGFR突变中也发现较多不常见的突变，这些突变累计约占EGFR突变NSCLC的10％（如19外显子插入、p.L861Q、p.G719X、p.S768I），虽然研究的患者数比较少，但研究结果也发现这些不常见的EGFR突变对EGFR TKI治疗响应^【6】。研究也发现一些EGFR突变（如20外显子插入）对EGFR TKI治疗缺乏响应^【7】，随着临床广泛使用NGS多基因检测技术，会越来越多发现其他各种EGFR突变类型，各种突变类型对EGFR TKI的治疗疗效需要更多研究数据支持。

对于EGFR敏感突变阳性的患者，国内外指南一线治疗优先推荐奥希替尼，其他可选择的药物包括吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼。NCCN指南也新增推荐厄洛替尼+雷莫芦单抗或贝伐珠单抗的联合治疗方案；对于使用一/二代EGFR TKI治疗进展后，推荐进行EGFR T790M的检测，若T790M阳性，推荐使用奥希替尼治疗，在检测方法上，推荐基于ctDNA的液体活检，若液体活检结果为阴性，再推荐进行组织活检，也可同时使用血液和组织样本进行检测。

2. ALK：ALK（间变性淋巴瘤激酶）是一种受体酪氨酸激酶，在NSCLC中发生基因重排，从而使得ALK激酶结构域持续激活并促进下游信号传导，导致肺癌的发生发展。ALK中最常见的融合伴侣是EML4，目前也发现了多种其他融合伴侣，存在ALK重排的肺癌对ALK TKI的治疗方案有响应^【8】。ALK重排阳性NSCLC患者一线治疗优先推荐艾乐替尼，其他可选择的药物包括克唑替尼、色瑞替尼、布加替尼，对于一线接受克唑替尼治疗进展的患者，可推荐使用色瑞替尼、阿来替尼或布加替尼作为治疗选择；对于一线接受色瑞替尼、阿来替尼或布加替尼治疗进展的患者，可推荐使用劳拉替尼治疗。

3. ROS1：ROS1（ROS原癌基因1）ROS1也是一种受体酪氨酸激酶，在NSCLC中发生基因重排，从而使得ROS1激酶结构域持续激活并促进下游信号传导，导致肺癌的发生发展。ROS1有多种融合伴侣，常见的融合伴侣包括：CD74，SLC34A2，CCDC6和FIG，ROS1重排的肺癌对ROS1 TKI的治疗方案响应^【9】。ROS1重排阳性NSCLC患者一线治疗推荐使用克唑替尼、恩曲替尼和色瑞替尼，对于一线治疗进展后的患者可选择劳拉替尼治疗。

4. BRAF：BRAF（B-Raf原癌基因）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是经典MAP/ERK信号通路的一部分。BRAF的激活突变通过MAP/ERK途径的信号传导激活下游信号通路，导致肺癌的发生发展。发生BRAF突变（p.V600E）的NSCLC对BRAF和MEK抑制剂的联合治疗方案响应^【10】。在NSCLC中也检测发现了BRAF的其他突变类型，对于这些突变类型的治疗方案的选择目前尚不清楚。BRAF V600E突变阳性患者一线治疗推荐达拉非尼+曲美替尼的联合治疗方案，如果不能耐受此联合治疗方案的患者，可以考虑单药威罗菲尼或达拉非尼可作为治疗选择。

5. KRAS：KRAS（KRAS原癌基因）是一种具有内在GTP酶活性的G蛋白，KRAS的激活突变通过MAP/ERK途径的信号传导激活下游信号通路，导致肺癌的发生发展。在NSCLC中KRAS突变最常见于第12位密码子，同时也存在其他的突变类型^【11】。与没有KRAS突变的肺癌患者相比，KRAS突变的患者预后不良^【12】，并且KRAS突变的患者对EGFR TKI治疗的响应显著降低^【11】，由于KRAS的激活突变与可靶向驱动基因的同时突变可能性低，若检测到KRAS的激活突变的存在，可提示患者不太可能从进一步的分子检测中受益。

6. NTRK：NTRK（神经营养因子受体酪氨酸激酶）基因融合发生于多种实体瘤，在NSCLC中发生频率较低（＜1%）^【13】，NTRK 1/2/3基因融合使得下游信号通路激活，目前已发现NTRK有多种融合伴侣，DNA-based NGS的检测方法不能检测到部分NTRK 1/3的融合，推荐使用RNA-based NGS的检测方法，针对NTRK融合阳性患者一线治疗推荐使用拉罗替尼或恩曲替尼^【14】。

7. PD-L1：PD-L1（程序性死亡配体1）是在肿瘤细胞上表达并可以抑制T细胞介导的细胞死亡的一种共调节分子。 T细胞表达PD-1，可与包括PD-L1（CD274）或PD-L2（CD273）的配体结合，在PD-L1存在情况下，T细胞活性被抑制。免疫检查点抑制剂抗体阻断PD-1和PD-L1相互作用，从而提高内源性T细胞的抗肿瘤作用，用免疫组化（IHC)的方法检测PD-L1的表达，可用于筛选可能对一线抗PD-1/PD-L1治疗响应的患者^【15】。FDA批准的基于肿瘤比例评分（TPS）的PD-L1伴随诊断方法，可指导派姆单抗用于治疗NSCLC患者，TPS是在任何强度下显示部分或全部膜染色的活的肿瘤细胞的百分比^【16】。尽管部分驱动基因突变的肺癌患者中PD-L1的表达升高，但是针对有驱动基因突变的靶向治疗方案应优先于免疫检查点抑制剂的治疗^【17】。

在PD-L1≥50%的非鳞NSCLC患者，优先推荐帕博利珠单抗单药和帕博利珠单抗联合培美曲塞+卡铂或顺铂；也推荐使用阿替利珠单抗联合卡铂+紫杉醇+贝伐珠单抗或阿替利珠单抗联合卡铂和白蛋白结合紫杉醇；有条件也可使用纳武利尤单抗联合伊匹木单抗；PD-L1表达≥50%的鳞癌患者，优先推荐帕博利珠单抗单药或帕博利珠单抗联合卡铂+紫杉醇/白蛋白结合紫杉醇；有条件也推荐使用纳武利尤单抗联合伊匹木单抗。

在PD-L1表达在1%-49%的非鳞NSCLC，优先推荐帕博利珠单抗联合卡铂或顺铂+培美曲塞；也推荐阿替利珠单抗联合卡铂+紫杉醇+贝伐珠单抗或阿替利珠单抗联合卡铂和白蛋白结合紫杉醇；有条件也推荐纳武利尤单抗联合伊匹木单抗；PD-L1表达在1%-49%的鳞癌，优先推荐阿替利珠单抗联合卡铂+紫杉醇/白蛋白结合紫杉醇；有条件也推荐纳武利尤单抗联合伊匹木单抗^【18-20】。

目前每种PD-1/PD-L1药物的PD-L1表达的检测平台和判断标准都不太一样，没有统一的标准，未来需要更多的临床研究数据来明确每个癌种、每种PD-1/PD-L1药物的PD-L1表达的检测平台和判读标准，来更加精准化地指导患者的免疫检查点抑制剂使用。

8. 其他分子标志物：除以上临床指南明确推荐需要检测的分子标志物外，NCCN指南目前也对其他新型的生物标志物进行推荐检测：

（1）MET扩增以及MET14号外显子跳跃突变：c-MET是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体超家族成员，HGF的结合导致细胞内激酶域中酪氨酸残基的二聚化和磷酸化，这种自磷酸化会导致信号传导，进而激活下游信号通路，使得肿瘤细胞增殖、转移和抗凋亡发生。在最近的两个月内，有两款MET抑制剂相继获批上市，分别是诺华的capmatinib在5月中旬于美国获批上市和默克的tepotinib在3月底于日本获批上市^【21-22】，NCCN指南也推荐发生MET变异的患者可使用克唑替尼治疗^【23】。

（2）RET重排：RET也是一种受体酪氨酸激酶，当RET基因出现点突变或基因重排时，会引起下游信号通路的激活，便会驱动肿瘤的发生。5月初，Loxo Oncology 公司的高选择性RET抑制selpercatinib于美国获批上市，用于治疗RET基因融合的NSCLC^【24】，NCCN指南也推荐使用非高选择性RET抑制剂：卡博替尼和凡德他尼治疗^【25-26】。

（3）ERBB2(HER2)突变：HER2是人表皮生长因子受体2，HER2的聚合作用会导致酪氨酸残基磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和癌症发生，其过表达或激活突变与肿瘤的恶性程度相关。指南推荐HER2突变的肺癌患者可考虑使用T-DM1治疗^【27】。

（4）肿瘤突变负荷（TMB）：TMB被定义为每百万碱基中被检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数，通常来说突变越多，则TMB越高，则患者更容易对免疫治疗发生响应。在非小细胞肺癌中开展的CheckMate­227临床研究，使用FMI的伴随诊断产品FoundationOne CDx检测TMB，结果表明：在TMB≥10mut/Mb的晚期非小细胞肺癌患者中，与铂类双联化疗相比，Nivolumab加低剂量ipilimumab治疗明显延长了1年的无进展生存率（42.6%vs13.2%），无进展生存期也显著延长（7.2月vs5.4月）^【28】；4月初，美国FDA基于Keynote-158研究的II期临床试验结果已受理Keytruda单药治疗肿瘤突变负荷高（TMB-H）且既往治疗后疾病进展的不可手术或转移性实体瘤患者，研究纳入751例经治且可评估TMB的晚期实体瘤患者，研究结果显示，非TMB-H的患者，Keytruda单药的客观缓解率（ORR）仅6.7%，而TMB-H患者的ORR可达30.3%^【29】，但目前TMB的检测方法和计算方法都没有统一标准，并缺少更多的前瞻性临床研究的伴随诊断的数据支持，因此TMB作为临床广泛应用的标志物，还需要未来更多的临床研究支持。

三、肺癌分子病理未来发展趋势

临床实践中对肺癌患者进行分子病理检测首选的样本类型是组织样本，包括新鲜肿瘤组织或FFPE样本，如果患者没有足够的组织样本进行检测，可以进行组织活检和/或采用血液样本进行检测，如果采用这些样本的检测方法都不可实现，则可以考虑使用其他的临床可及的样本类型进行检测，以可获得的检测结果来指导临床治疗。

目前临床针对不能或不愿取组织样本或活检穿刺样本的晚期NSCLC患者，比较多采用血液样本进行分子病理检测，但血液的分子病理检测不能替代组织的病理学诊断，病理学诊断是肿瘤诊断的“金标准”，研究提示ctDNA（血液循环肿瘤DNA）的检测有比较好的特异性，但灵敏度比较低，检测的假阴性率可能会达到30%^【30】，而且造血干细胞还存在克隆性造血突变的现象，这样对用血液样本进行分子检测的结果有一定影响^【31】，目前针对ctDNA的检测没有统一的标准，并且国内外肺癌临床诊疗指南没有把ctDNA的分子病理检测作为常规推荐，未来应用于临床的ctDNA NGS检测方法需要对检测的Panel和生信分析方法经过实验性能验证和临床试验验证。

目前临床可及的分子病理检测方法比较多，NGS多基因检测方法特别是大panel在肺癌的靶向治疗和免疫治疗过程中发挥着越来越重要的作用，未来在临床实践中需要结合具体的临床场景和患者需求，针对性采用不同的分子病理检测方法，NCCN指南建议在可行的情况下推荐采用广泛的NGS分子检测方法，对于使用NGS方法未发现驱动基因变异的患者（尤其是从不吸烟者），可考虑使用基于RNA的NGS检测以最大程度地发现基因融合事件，尽可能发现驱动基因变异，最终为肺癌患者带来更好的临床治疗方案指导和获益。

综上所述，非小细胞肺癌个体化治疗已从美好的愿景应用到临床实践，在这一趋势下，以二代测序（NGS）技术为代表的靶向精准检测方法已从科研实验室走向临床病理科的实际应用中，基于分子分型的靶向治疗、免疫治疗等精准治疗手段使肿瘤患者生存期及生活质量得到显著提高。

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