蛋白质芯片技术在衰老及衰老相关疾病研究中的应用价值

作者：李杨  王全会  孔双泉  尹长城

单位：北京华大蛋白质研发中心

【摘要】衰老是生物体随着时间的推移而自然发生的生理过程，也可能是应激、损伤、感染、营养失调、代谢障碍引起的病理性过程。不论是生理性衰老还是病理性衰老，均表现为机体退行性病变以及适应性和抵抗力减退。近年来的研究表明，衰老过程中自身抗体（Auto-antibody）可能与细胞老化、免疫系统改变，以及神经退行性疾病的发生等密切相关。蛋白质芯片是一种以无偏向性且高通量的方式研究自身抗体的有利工具，可以同时表征多达数千种自身抗原。这项技术的适应性使其在许多领域得到了广泛的应用，特别是在自身免疫性疾病、神经退行性疾病、炎性反应和癌症诊断标志物的发现研究中发挥了重要作用。本文综述了近年来蛋白质芯片技术在衰老及衰老相关疾病研究中的应用。

【关键词】蛋白芯片；衰老；自身免疫性疾病；神经退行性疾病

一、蛋白质芯片技术

1. 蛋白质芯片技术及分类：蛋白质是一类复杂的生物分子，具有多种结构和功能，以高通量的方式对其进行研究一直是一个巨大的挑战。蛋白质芯片即为对蛋白质进行高通量研究的一项技术。蛋白质芯片又称为蛋白质微阵列，是将纯化或合成的蛋白质、亲和试剂等固定在特殊载体上而形成的微阵列。目前，一般将蛋白质芯片分为正向和反向两种，其中正向蛋白质芯片根据其构建及应用不同又可分为功能性蛋白质芯片和分析性蛋白质芯片。功能性蛋白质芯片是由纯化或合成的蛋白质构建的，能够同时探测数百甚至数千种不同蛋白质的生化特性。分析性蛋白质芯片使用固定在阵列上的亲和试剂来检测或定量分析生物样品中的蛋白质。反相蛋白质芯片则是利用固定在阵列上的复杂生物样品中的蛋白质来检测特异的结合抗体或其他物质。

它与蛋白检测常用的其他检测手段相比（比如质谱），功能蛋白质芯片具有检测弱相互作用的能力，对低丰度蛋白质的检测更为灵敏，对血清等原始样品的分析更为方便、要求更低。目前，根据蛋白质组覆盖率、蛋白质长度和技术平台的不同，已经开发出了许多不同类型的功能性蛋白质芯片。如蛋白质组芯片、蛋白质家族芯片、蛋白质结构域芯片和cDNA体外翻译或体外合成的蛋白/多肽芯片等。功能蛋白质芯片在研究蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、蛋白质-药物相互作用等领域具有广泛的应用。

图1. 蛋白质芯片的应用。

A为检测蛋白质-蛋白质相互作用，B为检测蛋白质与脂类结合，C为检测蛋白质与细胞或细胞裂解液的结合, D为检测蛋白质与小分子的结合，E为底物发现，F为检测蛋白质与DNA的结合，G为检测蛋白质与RNA的结合，H为检测血清种的自身抗体。图片引自文献^[1]。

2. 蛋白质芯片的构建：蛋白质组芯片的构建首先需要将全基因组的开放阅读框架（ORFs）集合组装到表达载体中，在细胞中表达编码的蛋白质，然后以高通量方式纯化单个蛋白质，并将蛋白质固定在微阵列载体上。目前，蛋白质芯片覆盖了多种模型系统，包括冠状病毒、黄病毒、人类疱疹病毒、结核分枝杆菌、大肠杆菌K12、酿酒酵母、拟南芥和人类^[1]。由于ORF的覆盖度和蛋白质表达或纯化的效率不同，蛋白质组在这些阵列上的覆盖范围从56%到95%之间不等。蛋白质表达系统极大地影响翻译后修饰，并且影响蛋白质纯化的成功率。同源表达系统通常是获得最高蛋白活性和表达效率的首选。但在某些情况下，转染细胞存在一定难度并且价格非常昂贵，尤其是哺乳动物细胞。因此可以使用其他表达系统，如酿酒酵母，来进行高通量蛋白质表达。事实上，人类蛋白质组芯片（即HuProt™）是使用异源表达系统的最佳例子之一，因为它展示了从酵母中纯化的最全面的人类蛋白质组（最新版本HuProt™ V4.0，包含超过21000个独特的人类蛋白质、亚型变体和蛋白质片段），覆盖了16794个独特的基因。根据人类蛋白质图谱的定义，这涵盖了蛋白质组各主要功能类别中超过81%的人类蛋白质^[1]。另一种商业化的人类蛋白质组芯片称为ProtoArray，包含从昆虫细胞中纯化的超过9000种人类蛋白质（蛋白质组覆盖率为43%），但已在2018年停止生产了。

蛋白质家族芯片则可以根据研究目的将具有特定生物化学功能的一组蛋白质固定到载体上。目前有许多蛋白质家族芯片，比如用于药物应用的G蛋白偶联受体（GPCR）芯片、用于分析自身抗体的膜/分泌蛋白芯片、用于研究流感疫苗的血凝素抗原阵列和用于分析免疫应答的HIV的gp120/140芯片。由于大多数蛋白质家族芯片含有相对较少的蛋白质，因此可以根据所需的质量和数量来定制表达系统。还可以设计蛋白质结构域芯片来分析蛋白质中的某些区域、结构域或表位。       

二、蛋白质芯片是研究自身抗体谱的良好平台

由于功能蛋白质芯片可以作为抗原平台，用以检测抗体组成的细微变化，因此功能蛋白芯片最典型的应用是发现自身免疫性疾病中新的血清生物标记物^[5]。当一个功能蛋白质芯片覆盖大部分人类蛋白质组（如HuProt™）时，通过用稀释的患者血清/血浆样本与该阵列进行反应，可以很容易地检测到特定的人自身抗体信号。这种技术可用于描绘一个大队列样本的自身抗体谱特征，随后运用统计分析揭示与感兴趣疾病相关的潜在生物标记物。这种技术有三大优点：首先，患者样本很容易获得和储存，因为它们大多以血清、血浆或体液的形式存在，而这些都是可以很容易地与蛋白质微阵列进行反应的；其次，在人类蛋白质组阵列上检测人自身抗体非常灵敏且容易实现定量，只需要几微升的样本；最后，自身抗体往往在症状产生之前就存在了，通过监测其变化，使早期诊断成为可能。

人类蛋白质组芯片（HuProt）目前已被用于13种以上自身免疫性疾病的自身抗体谱研究，包括自身免疫性肝炎^[6,7]、强直性脊柱炎^[8]、多发性硬化症^[9,10]、I型糖尿病^[11]、类风湿关节炎^[12]、唾液中的干燥综合征^[13]、原发性胆汁性肝硬化^[14]、肌萎缩侧索硬化症^[15]、男性亚生育期^[16]、青少年特发性关节炎^[17]、白塞氏病^[18]和结节病^[19]、阿尔兹海默病^[34]。对于生物标志物的鉴定，使用包含最全面的人类蛋白质组集合以进行无偏好性的筛选是非常必要的。

研究认为，肿瘤的发生也会导致人体自身抗体谱的异常变化，因此，人类蛋白质组芯片也被广泛应用于各种类型肿瘤的自身抗体分析以发现诊断或治疗标志物，包括卵巢癌^[20,21]，胶质瘤^[22]、肺癌^[23]、胃癌^[24]、膀胱癌^[25]、前列腺癌^[26]、结肠癌^[27]、乳腺癌^[28]、骨髓增生异常综合征^[29]和脑膜瘤^[30]等。如Orenes-Pinero等研究者，在蛋白质芯片上进行血清样本检测分析，鉴定出171种与膀胱癌相关的自身抗原。他们通过使用组织芯片验证了该结论，并最终确认Dynamin不仅是一种自身抗原生物标记物，而且还与低生存率相关^[31]。

三、衰老与自身抗体的变化密切相关

从生物学上讲，衰老是生物体随着时间的推移而自发的必然过程，是一种复杂的自然现象，表现为退行性病变和机能的衰退、适应性和抵抗力减退。从病理学上，衰老是应激和劳损，损伤和感染，免疫反应衰退，营养失调，代谢障碍等。研究发现，随着年龄增长，免疫系统反应能力降低，导致具有炎症成分的各种慢性疾病的发生率增加（或称“炎症老化”）。在失调的免疫系统中，由体液免疫产生并与自身抗原反应的抗体称为自身抗体（Auto-antibody，AAbs）。近年来的研究表明，衰老过程中自身抗体可能涉及细胞老化与“清创”能力的减弱、免疫系统改变、以及神经退行性疾病的发生等方面。

早在1990年Stone的文章中就提到，自身抗体的数量随着年龄的增加而增加，但研究者不认为是由于衰老本身造成了自身抗体的增加，而是可能与衰老过程中伴随的一些病理变化有关。研究发现炎症反应随着年龄的增长而减弱，清创功能也在减弱。改善组织清创能力并不能阻止最终衰老，但可以减少衰老的一些病理、生理变化，提高其生活质量^[2]。Attanasio 等研究者使用了健康狒狒作为灵长类的代表进行自身抗体反应的分析，结果表明，从幼年狒狒到老年狒狒，抗核抗体、抗细胞提取物抗体和天然自身抗体的产生逐渐显著增加，而血清免疫球蛋白浓度水平并无相应增加，说明随着年龄增长和衰老的发生，自身抗体谱发生了改变^[3]。在Kay等的研究中发现在“老化”细胞上出现一种衰老抗原，可以启动IgG自身抗体的结合并随后被吞噬细胞清除，因此衰老抗原的出现可能作为细胞生命终止的特定信号。而且，针对衰老细胞抗原的抗体可以区分AD病人脑组织和正常脑组织[4]。这种衰老抗原及其自身抗体的出现，也提示衰老相关自身抗体谱的变化，说明通过自身抗体的筛查，可能寻找到有效的生物标志物，进行疾病的早期诊断。

四、蛋白质芯片在衰老及衰老相关疾病中的应用

1．长寿人群的研究：为了探讨衰老的可能机制，研究者对长寿人群进行了分析，以阐述长寿人群在蛋白质组和自身抗体谱中的特征。在Ye等的研究中^[32]，研究者对中国巴马瑶族自治县长寿家系人群血浆蛋白质组学和自身抗体谱进行了分析。研究者使用TMT标记定量的方法和HuProt™蛋白质芯片技术分别对同一地区的长寿家系后代和非长寿家系后代（均为年龄大于18岁的成年人但并非按年龄分组）的蛋白质组学和自身抗体谱的差异进行了阐述，尽可能地避免了环境因素对实验结果的影响（直系亲属中至少有三人寿命大于85岁的被归类为长寿家系）。研究选用了来自66名志愿者的血浆，其中33个为长寿家系人群，另外33个为与这些长寿家系人群年龄、性别、血型相匹配的非长寿家系人群志愿者。实验时将每11个样本等体积混合为1个生物学重复，因此长寿组和非长寿组分别有3个生物学重复。通过基于质谱的蛋白质组学方法，研究者鉴定到了598个蛋白，其中525个蛋白具有有效定量值。对比长寿组与非长寿组（参照组），以P小于等于0.05，和差异倍数大于1.2倍为标准进行差异蛋白的筛选，共找到17个差异蛋白，但其中有部分蛋白属于同一个蛋白的不同剪切模式。最后对应到12个差异蛋白，其中5个下调、7个上调。通过差异蛋白的功能分析发现其主要代表功能是结合和催化活性，参与了免疫、代谢、细胞粘附和信号传导等多种生理途径。其中脂蛋白（a）（LPA）被认为是冠心病和中风等动脉粥样硬化疾病的危险因素。遗传和流行病学研究也表明，没有LPA或LPA水平很低的个体似乎更加健康，而与心血管健康相关的因素可能也与长寿有关。在这篇文章的研究结果中，LPA被发现在来自长寿家系的后代中大部分被下调。另外还有防御素3（DEFA3）、蛋白二硫异构酶（PDIA3）、PDIA3、胆绿素还原酶B（BLVRB）等，这些蛋白的低表达，在相关文献中曾被报道可能参与先天免疫应答、肾纤维化或细胞氧化还原等过程。另外一些蛋白质在长寿家系后代中被发现上调，包括整合素β3（ITGB3，CD61）、嗜铬粒蛋白A（CHGA）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src、桥粒蛋白-2（DSG2）、原肌球蛋白（TMP）等。这些蛋白在相关报道中有些可能参与细胞粘附和细胞表面介导的信号传导、有些与癌症的进展有关等。

应用HuProt™蛋白微阵列芯片对同样的血浆样本进行自身抗体的检测，发现血浆自身抗体识别了500多种蛋白质。其中在长寿组中，自身抗体识别出的蛋白数目为652、695和652，有553个蛋白是三个生物学重复所共有的。在非长寿组中，自身抗体分别识别出668、585和622个蛋白，三个生物学重复共有的蛋白韦 508个。对上述553和508个自身抗原的功能类别进行分析。结果表明，两组所识别抗原的功能类别基本相同。为了检测长寿组和非长寿组后代特异表达和差异性表达的自身抗体，对血浆中IgG所识别的所有抗原进行定量分析。同组内三个生物学重复筛选标准为：至少在两组重复中出现倍数变化＞1.2或＜0.83（p＜0.05）的抗体为差异表达的自身抗体。本次实验中特异表达和差异性表达的自身抗体共14种，其中6种（CASC4、DPY30、PMVK、HSPA2、IFIT3、SCRN2）为长寿组的特异性反应，1种（ZNF207）为非长寿正常组的特异性反应，7种（ARL2BP、GCK、ING3、NXPH2、RUVBL2、TPD52L1、ORMDL2）与两组均有特异反应但存在表达量的差异。此外，在这14种鉴别出的特异/差异抗原中，有12个与长寿组的抗体特异反应或有更高的含量。而在这12种蛋白中，有5种被报道与癌症有关：CASC4的表达减少已被证明能抑制胃癌的增殖；TPD52L1是一种细胞周期调节蛋白，在乳腺癌细胞G2-M期表达最大；Secernin 2（SCRN2）是胃癌中的肿瘤相关抗原；生长抑制因子家族成员3（ING3）的过度表达已被证明抑制细胞生长并诱导凋亡；RUVBL2在转录调控和DNA修复中发挥作用，它还通过与致癌转录因子的相互作用参与癌症相关过程。还有一些曾被报道参与心血管疾病、糖代谢、转录调节、降低氧化应激和抑制凋亡、免疫系统相关的细胞信号传导等等过程。而在正常组中，只有锌指蛋白（ZNF207）和内质网定位的跨膜蛋白（ORMDL2）发生了特异性或更强的反应。总的来说，本研究发现在长寿人群和非长寿人群之间存在蛋白质组和自身抗体谱的差异，而且大多数差异蛋白和自身抗原被认为某些生理和病理过程中发挥着重要作用。这些发现将有助于更好地揭示长寿之谜。本研究所发现的差异表达蛋白和自身抗体对长寿的影响及其分子机制有待进一步研究。

2. 神经退行性疾病：衰老相关疾病中重要的一类是以阿尔兹海默病（AD）和帕金森病（PD）为代表的神经退行性疾病，需要尽早诊断和干预治疗。通常AD在最初发病的5-10年内很难被注意到。目前的诊断方法包括神经成像技术、行为史评估和神经精神测试。但这些方法本身或联合诊断都不能提供早期检测或高准确度检测。因此，迫切需要一种准确的、相对无创的、廉价的方法对AD进行诊断。鉴于人类血清中存在数量众多的自身抗体，高通量蛋白质芯片技术被用来评估神经退行性疾病患者自身抗体谱，进而寻找可能的早期诊断标志物。DeMarshall等人研究了132例帕金森患者的血清自身抗体，以R’s Random Forest预测方式，将数据分为训练集和测试集计算ROC分析的指标，发现MARK1及其两个同源蛋白脑特异性激酶1（BRSK1）和微管亲和力调节激酶4（MARK4）是其重要的生物标志物^[33]。Nagele等人则利用人类蛋白质芯片分析了AD组和非精神控制对照组（NDC）血清自身抗体谱的差异。研究者选择了50名AD受试者和40名对照者的血清样本、30份乳腺癌（BC）血清样本和29份帕金森氏病（PD）。考虑到早期诊断的需求，AD血清库包含了最小精神状态检查（MMSE）分数为2-24分的样本。根据AD组和NDC组之间患病率的差异，按降序排列可检测到的自身抗体，而后使用随机森林（RF）测试所识别生物标记物的预测分类准确度。研究发现，用排序前十的10种自身抗体对所有AD和NDC样本进行RF分类时（n=90；50ad，40ndc），其敏感性和特异性分别为96.0%和92.5%。10个生物标记物对包含早期AD、晚期AD、较老的对照组和较年轻的对照组的其他样本队列进行分类分析发现，分类的准确率超过90%。为了确保疾病的特异性，将AD与非神经和其他神经系统疾病区分开来，研究者又收集了30份乳腺癌血清样本，并用选出的10种诊断生物标记物将乳腺癌样本与50份AD样本进行了鉴别，同样得到了有效区分。值得注意的是，仅使用其中五种诊断生物标记物（FERM domain containing 8、Spleen tyrosine kinase、Mediator complex subunit 29、Transglutaminase 2、Leiomodin-1），就可以将AD样本与PD这两种非常难以分辨的疾病种类区分开来，证明了所发现的自身抗原标志物的诊断特异性。最后，研究者采用Dot-blot对其中两种最有效的分化抗原PTCD2和FRMD8进行了验证，证实AD血清中抗FRMD8和抗PTCD2抗体比NDC血清中更为主要，因此有可能作为诊断性生物标记物。总的来说，作者认为疾病的存在可以引起血清自身抗体谱的特征性改变，从而使自身特异性抗体及其抗原可以作为进行中/早期疾病的诊断生物标记物。但同时，作者也认为人类血清中，特别是年轻人和健康人血清中存在大量自身抗体的根本原因尚不清楚，免疫系统对过去免疫行为的记忆和正在进行的疾病的影响难以区分，在大规模自身抗体的研究中尚存在较大干扰^[34]。受限于每一种分析方法的不同，利用微阵列发现的产生显著变化的自身抗体尚有很多未被有效分析，后续还有很多研究价值待挖掘。

五、展望

人类蛋白质组芯片在基础及临床应用研究中都得到了广泛应用，为蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰、疾病标志物筛选、药物靶标筛选、抗体筛选等研究提供了有力的支持。蛋白质芯片在衰老及衰老相关疾病中也有相关研究案例，但在数据量、实验设计及分析深度上还有很多有待深化的空间。比如，在上述长寿相关的研究中，作者采用的个体全部来自同一地区，还应进行多个地区长寿人群的研究方能得到更有说服力的结果；且长寿组与非长寿组都仅有33例样本，在数量上具有一定局限性。由于生物个体之间的差异，进行个体化研究，并通过统计学分析以得到更可信的结果是比较好的策略，可以避免混样造成的样本间信息的遮盖和混淆。蛋白质芯片支持样本独立检测和样本间归一化，使得组内数据统计和组间数据比较能够拥有良好的基础。另外，在数据挖掘深度上，还有很多工作可以开展。比如特定抗体占自身抗体总和的比例、更多自身抗原在老化过程中的功能研究等，在衰老机制及衰老相关疾病研究中都具有十分重要的意义。

人类蛋白质组芯片HuProt™还在持续更新，目前最新版本（SARS-CoV-2huprot™）更是结合了21000多种人类蛋白和SARS-CoV-2的蛋白，可以为相关研究提供更加全面的信息。随着HuProt人类蛋白质组芯片覆盖度的不断扩充，相信其在科学研究乃至临床应用上将会受到更多的关注。

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