全自动化微生物检验流水线临床应用中应注意的问题
作者：白露 郝晓柯
【摘要】随着实验室自动化概念广泛应用于生化，血球和免疫领域，微生物检验由传统手工到自动化的变革也逐步由概念变为现实。样本量逐年增加，预算有限，人手短缺是微生物实验室现阶段普遍面临的难题，全自动微生物流水线成功将标准化，自动化，智能化等手段应用到繁重且高度重复的微生物日常操作中。（1）在提升检验质量的基础上显著提高工作效率；（2）减轻工作量改善工作环境的同时提高了操作人员的生物防护；（3）缩短TAT，建立与临床及时有效的沟通；（4）节省人力成本及实验室操作成本。现在市场占主导地位的两大品牌分别是美国BD Kiestra和意大利Copan WASPLab，他们分别推出了全自动微生物流水线的不同模块化产品；现阶段国内厂家也开始进入微生物样本前处理领域。本文主要总结全自动微生物流水线在临床微生物检验的应用进展，比较BD Kiestra和Copan WASPLab在产品参数、实验室流程改善、数字化阅板、LIS连接几个方面的主要差异。
【关键词】全自动微生物流水线，BD KiestraTLA，Copan WASPLab，临床微生物检验
临床实验室诊断结果将直接辅助临床医生制定相应的诊断和治疗方案，随着检测项目的增多，检测量的逐年增加，技术人员相对短缺是临床检验科室面临的共同问题。基于以上需求，实验室自动化流水线广泛应用于生化，血球和免疫领域。微生物检测由于样本类型多样，检测项目因样本类型而异，且采集容器无法统一，曾被认为无法实现全自动化。现在，自动化血培养、质谱鉴定和自动化药敏已在临床微生物科室普及。但在新冠疫情的影响下，微生物实验室呼吸道样本急剧增加，人手短缺，大量重复繁重的手工操作，有限的预算及实验室空间等瓶颈依然存在，限制临床微生物检验的发展。全自动微生物流水线的实现可顺利解决上述问题，相对传统手工操作，自动化流水线需要更少的实验室操作人员，却能提供更高效、更准确的检测结果，显著缩短TAT，改善实验室工作流程。但作为微生物流水线的先行者，同样面临巨大的挑战和改变【1】。现在市场占主流的两大品牌分别是美国BD Kiestra TLA 和意大利COPAN WASPLab，他们分别推出了全自动微生物流水线的不同模块化产品，且在硬件和软件上进行不断的更新升级【2-4】；现阶段国内如朗迈生物，安图生物及百博生物等厂家也开始进入微生物样本前处理领域。本文主要总结全自动微生物流水线在临床的应用进展，比较KiestraTLA和WASPLab在产品参数、实验室流程改善、数字化阅板、LIS连接几个方面的主要差异，期待能为正在或计划实施全自动微生物解决方案的同行提供参考。
一、全自动微生物流水线的产品参数
BD Kiestra TLA由平板储存与分选模块（SorterA），条码打印模块（BarcodA），接种划线（全自动/半自动）模块（InoqulA），智能孵箱模块(ReadA Compact)和在线工作台(ErgonomicA)等几个模块组成，不同模块之间通过双向的ProceedA轨道进行连接，可实现从扫码接收到调取平板到工作台的闭环操作流程，BD Kiestra WCA与TLA的主要区别在于单向轨道和离线工作台，对于中等样本量及场地有限的微生物实验室将是性价比较高的配置选择。Copan WASPLab系统类似于BD Kiestra WCA，由前处理系统（WASP），并由单向的轨道连接前处理、智能孵育系统，且由自由移动的工作台模块组成【2, 5】。后续的阅板及ID/AST在可工作台上进行操作，离线工作台在与COPAN WASPLab联机后可实用不同工作地点更灵活多样的办公阅板工作模式【5-9】。
1. 前处理模块：BDKiestra TLA可提供全自动（FA）和半自动（SA）两种模式，FA模式主要应用于临床液体样本，如血液，脑脊液，胸腹水和尿液。SA模式主要应用于非液体标本，如痰液，大便，分泌物等。SA接种模块配备有2级生物安全柜，HEPA过滤系统最大限度保护操作人员的安全，特别是对于国内样本量突出的呼吸道样本，Kiestra的SA接种模块可高效的完成样本的接种及划线。WASP可实现运行过程中添加样本中，上样更加快捷便利，配备的离心系统更能满足样本前处理的要求。WASP的接种环有1/10/30ul/双头双环/涂布环，可根据设定接种方案，自动换环无需手动切换，并可根据客户试验接种量的需求多次取样，倍比增加样本量。InoqulA FA模式最低接种为10ul，采用移液枪定量吸取，接种量可根据实际需求进行自定义设置；SA模式可人为调整接种量，需人工点样完成。InoqulA可满足5块不同平板同时按不同方式划线，采用专利的磁珠划线技术，15种预设划线模式可供用户选择。整个过程闭盖完成，避免气溶胶及交叉污染，需要另外配备磁珠及专用的接种枪头。WASP划线需依次完成，接种环为单环双头，配高温灭菌炉及接种环清洗液，可进行40000次循环使用，全过程在密闭的接种模块中完成。划线模式的选择可根据不同标本类型选择适宜的划线模式，并可根据客户划线要求定制，亦可使用分板培养基，进行一板两种培养基的双线划板模式。Kiestra和WASP都采用了HEPA系统，全程保障实验室生物安全管理，避免气溶胶风险【4-8】。其中，COAN WASP系统中的可添加肉汤培养基接种模块、KB药敏制备模块是区别于kiestra的模块，对于KB药敏工作量大的实验室将是较好选择，Cepheid Xpert自动加样模块及蜂鸟系统（Colibri™）模块【5-6】，该系统可实现质谱靶点自动挑取点样及MIC药敏的前处理自动化，可兼容于：Bruker MALDI Biotyper，bioMérieuxVitek MS，Beckman Coulter，MicroScan Walk Away-96，MicroScan Walk Away-40，bioMérieuxVitek 2 X，bioMérieux，Vitek 2 60等仪器，见图1。另可选配人工划线平板入孵箱叠加模块（Plate Loading Carrousel），涂片制备模块 （Gram Slide Prep Module），及协作式机器人接种系统（Collaborative robot），类似于BD Kiestra半自动（SA）模式，但由协作机器人操作无需人工干预。BD InoqulA FA系统可添加涂片制备模块，肉汤培养基接种模块，另亦可匹配鉴定模块（可实现质谱靶板制备）及药敏制备模块。具体参数见表1。
图1. BD Kiestra TLA及COPAN WASPLab的工作模块组成图示
图2. COPAN WASPLab中的蜂鸟系统（Colibri™）
表1. InoqulA（BD Kiestra）与WASP（COPAN）参数比对
*以上仅代表截稿日期之前的数据结果，并由各自制造商审查
2. 智能孵箱模块：接种后的平板通过轨道输送到孵箱进行孵育，并按预设的时间节点进行拍照，整个过程通过平板的条码进行追踪和记录。ReadA是采用固定的培养箱卡位，单个孵箱可放置1152块平板，可设置普通培养和CO25%培养条件。WASP采用移动式的培养仓位，单个孵箱可放置795块平板，另可应用，单门双孵箱系统可实现1590块平板的放置，以满足空间有限的实验室，最大平板量放置的要求。和普通培养箱最大的区别在于，智能孵育箱配备了平板拍照系统，可按照用户自定义的时间点进行多次拍照，可记录平板上菌株的整个生长过程。根据光源和拍照模式的不同，可分别设置拍摄突出菌落和突出溶菌环的图片。智能孵箱的另一大优点是均一稳定的培养环境可显著缩短培养时间，有效缩短TAT。ReadA采用独立的三层轨道分别进行平板的输入，输出和拍照，整体运行速度主要受限于机械抓手的运行效率。WASPLab具有两个机械臂和一条输入轨道（也可选配多条轨道），整体运行速度主要受限于轨道的运输等待【5-9】。参数比较见表2。
表2. ReadA compact与WASPLab参数比对
*以上仅代表截稿日期之前的数据结果，并由各自制造商审查
3. 平板影像判读模块：平板影像系统与传统判读最大的区别在于可以设定不同的精确的孵育时间，并进行拍照影像保存，可时时观察菌落的生长情况；平板亦不需要反复从孵箱拿进拿出，通过阅板工作站的系统软件，可将生长平板的高清图片显示在屏幕上供实验人员判读。对于阳性菌落可直接在图片上进行标记后续ID/AST，分纯，其他实验等操作。对于阴性平板，在培养程序结束后，将被自动移出孵箱并分类堆叠到指定卡位。对于待查阅平板，KiestraTLA可实现从孵箱自动输送到在线工作台。平板影像系统可支持不同操作人员在不同的工作场所对平板结果进行判定，显著提供人员工作效率；且可以永久保存菌落的图像记录。Kiestra平板影像系统（软件Synapsis）的另一大趋势是支持阴性平板自动批量报告，这样操作人员可把时间集中用来处理阳性样本，优化工作流程的同时缩短TAT。在影像阅板的软件应用系统中，Kiestra系统及WASPLab系统可进行动态检测、半定量、显色培养基鉴定（例如：MRSA、VRE）及自动测量抑菌圈等功能也将极大提高阅板效率。新开发的Machine learning algorithms技术已研发专用软件可识别血液和尿液标本培养出的大肠埃希菌的菌落形态但该检测技术待更大样本的临床验证及应用评估【5,8-12】。平板影像系统的另一种应用，是进行血培养阳性标本转种后的自动直接筛查。传统的培养模式，通常至少16-24小时的孵育时间。结合流水线的数字成像能力及精确的孵育时间，可实现90%血液培养阳性标本在5小时内测试。这样以来，对于脑脊液及血液样本能且最大提醒操作人员进行后续ID/AST，缩短TAT【13】。这在两个厂家的系统上都有较好的体现。
二、全自动微生物流水线实验室流程
1. Kiestra TLA实验流程：
（1）SorterA，平板储存与分选；
（2）BarcodA，条码打印与平板粘贴条码；
（3）InoqulA,平板接种与划线；
（4）ProceedA输入/输出轨道；
（5）普通培养孵箱；CO2培养孵箱；
（6）在线阅板工作台。见图3。
图3. Kiestra TLA实验流程图
2. WASPLab实验流程：
（1）WASP前处理模块；
（2）输入/输出轨道；
（3）普通培养孵箱；CO2培养孵箱；
（4）输出堆叠机；
（5）离线阅板工作台。见图4。
图4. WASPLab实验流程图
三、全自动微生物流水线的实验室信息系统管理
全自动微生物流水线的实现离不开与实验室信息系统（LIS系统）的整合，与实验室信息系统的有效交互也是一个不断发展的挑战，因为系统软件、中间软件和实验室信息系统的升级，给实验室带来了新的机遇。但由于LIS供应商属于三方公司，LIS系统的兼容性及功能开发参差不齐，且与LIS系统对接的高额费用也是科室与厂家要面临的问题。现阶段全自动微生物流水线与LIS的双向通讯基本都是通过中间体软件完成的。且通过不同的控制模式，可以实现同一个病人的信息在LIS系统和判读软件上同步显示，阴性结果可自动审核并发送最终报告。
综上，微生物流水线自动化系统如在现代临床微生物实验室中发挥作用，自动化系统必须具备足够的灵活性，以适应技术人员在基于培养的微生物检测中分析前、分析中和分析后各个阶段高度的变化性。分析前标本处理阶段：虽现有COPAN Swab系列这一个标准化的标本容器类型，可保持微生物的活力，并作为类似采血管的方便运输模式，使微生物标本采集的形成统一独特的增长模式。但与此相反，微生物实验室会收到的许多来自不同来源的标本（例如，粪便、骨、组织等），由具有各种标本形状因素的不同容器（采样杯、采用管、和拭子等）提交到实验室，因此，可能需要不同的处理方式。如可统一标本容器类型且必须是螺旋盖口，BD Kiestra TLA（FA）和COPAN WASPLab自动化系统都可设计兼容匹配。如尚不能统一标本容器，BD Kiestra TLA（SA）是不错的选择， 且对于国内样本量最大的呼吸道样本，如痰液和肺泡灌洗液等，在不液化的前提下很难实现上自动化设备的应用。半自动接种模式可以较好的解决呼吸道样本这个问题，且接种效率要优于自身的FA全自动模块，在现有的装机用户中，SA模块被使用的频率更高。在COPAN协作机器人的应用中，可类似于BD Kiestra TLA（SA）系统，将由机器人完成点样过程，目前国内尚未安装，我们亦期待其同样能有不俗的表现。分析中：在进行全自动化流水线的应用时，微生物技术人员的工作经验是必须的，如何对于系统正确操作，及区别于肉眼直接阅板的工作方式都必须进行培训；工作流程也需要合理的优化，我们悉知微生物检测包括从接种到鉴定的各个环节，建议流水线系统配置一个技术人员专门从事一个任务（例如，培养板的读取与ID/AST人员按照环节区分）。这样可以减少在不同任务之间切换的时间，形成工厂流水线样的工作协作模式，从而提高效率。当然，任何一种工作模式的可行性，都需要各个实验室评估建立适合自己的系统工作模式，学习如何最大限度地利用资源及人员配置，这是最重要的挑战。最终，如由精通微生物检测、能够流畅应用软件并能解决日常简单问题的技术人员组成团队，微生物全自动流水线系统将得到最好的利用。
临床微生物学尚处于采用自动化流水线系统的初期阶段，并正在评估和利用这一新的技术方法，通过优化操作流程，标准化操作，能减少大量重复操作并能提高检测效率，智能孵育及平板影像系统显著缩短培养时间，提高判读效率。加上质谱快速鉴定的普及与整合，TAT能大幅缩短。需要明确指出，微生物自动化流水线系统这一领域正在迅速发展，因此，上述文中所描述的每种仪器的系统模块及应用软件可能很快就会升级或更替。精确评估微生物流水线的价值，尚需一个实践再回顾的过程。总结已发表的文献，已装机用户的在人员数量减少30%的情况下，工作效率提高了27%【14-15】。微生物全自动流水线会大幅降低实验室出错及浪费的成本，从而节省检测成本。TAT的缩短可减少病人住院天数，节省住院费用，提高医院床位周转，提高医疗质量。一切技术的应用，都在打破传统的格局，旨在更好地服务临床。
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