侵袭性假丝酵母菌病的病原学诊断
作者：刘小平 樊尚荣
侵袭性假丝酵母菌病（invasive candidiasis，IC）是临床上最常见的侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD），俗称侵袭性念珠菌病。是指假丝酵母菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖导致组织损害、器官功能障碍和炎症反应的病理改变及病理生理过程。
侵袭性假丝酵母菌病分为3个亚类：无深部或内脏受累的菌血症，有深部或内脏假丝酵母菌感染的菌血症，以及无菌血症的深部（内脏）假丝酵母菌病，每个亚类都大约占1/3。
深部假丝酵母菌可致全身各个器官感染，其所致疾病包括：循环系统：假丝酵母菌血症、心内膜炎、化脓性血栓性静脉炎、其他心血管假丝酵母菌病等。中枢神经系统：脑膜炎、脑脓肿等。运动系统：骨髓炎、关节炎、肋软骨炎、肌炎等。消化系统：腹膜、肝、脾、胆囊假丝酵母菌感染等。尿路感染：尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、肾周脓肿。呼吸道感染：肺炎、肺脓肿、支气管炎、喉炎、会厌炎等。眼睛：眼内炎等。播散性假丝酵母菌病（disseminated candidiasis）：假丝酵母菌血症的症状和多器官感染的局部表现，血培养假丝酵母菌阳性。
一、侵袭性假丝酵母菌病的流行病学
侵袭性假丝酵母菌病死亡的病死率5%-71%，假丝酵母菌血症的死亡率15-40%，ICU粗病死率40-55%。病死率高低取决于临床表现与抗真菌药物治疗的时间。早期诊断和开发更高灵敏度和特异性的新型诊断技术至关重要。感染源控制是治疗的重要部分，特别是在血管内导管相关性假丝酵母菌血症时IFD与患者免疫功能低下有关，特别是存在恶性肿瘤、慢性炎症性疾病及慢性免疫抑制的患者。ICU有IFD风险的患者数量正在增加。ICU血流感染中，假丝酵母菌属是最常见的真菌病原体。以白色假丝酵母菌为主，非白色假丝酵母菌感染也占一定比例。白假丝酵母菌（C. albicans）、光滑假丝酵母菌（C.glabrata）、近平滑假丝酵母菌（C. parapsilosis）、热带假丝酵母菌（C. tropicalis）和克柔假丝酵母菌（C. krusei）占侵袭性假丝酵母菌的90%[1-4]。
二、侵袭性假丝酵母菌病的发病机制
异常定植、入侵、感染。假丝酵母菌属是人类微生物群的一部分，定植于皮肤、胃肠道及泌尿生殖道。侵袭性假丝酵母菌病通常因正常菌群浓度与分布改变以及粘膜屏障功能改变所引起。危重病患及对其开展的相关治疗可导致微生态失调与正常屏障功能破坏，引起包括假丝酵母菌在体内的正常菌群移位。长时间住ICU和广谱抗生素的应用与侵袭性假丝酵母菌病相关。其他危险因素包括留置中心静脉导管（尤其是用于全胃肠外营养）、血液透析、大的胃肠手术、坏死性胰腺炎、糖尿病及免疫抑制的疾病。此外，假丝酵母菌的致病性可因其粘附假体表面和形成生物膜的能力而得到增强。生物膜的形成在对抗真菌药特别是唑类的耐药性方面起着重要的作用。
侵入性假丝酵母菌感染的危险因素包括：机体免疫状态严重受损、基础疾病如各种原因导致的免疫功能受损、中性粒细胞持续低下、糖尿病、恶性肿瘤等，这部分患者感染源主要来源于消化道，以内源性感染为主。合并症如早产、化疗食管炎患者、需要透析患者、慢阻肺、重症流感或肺炎等也是感染的危险因素。
医源性损伤如医院侵入性操作：这部分患者组织完整性受到破坏，皮肤黏膜屏障功能受损使病原菌进入血液循环，如外科手术、使用血管内导管或中心静脉导管、心室辅助装置、导尿管留置、气管插管及气管切开、部分烧伤患者等，这些患者以外源性感染为主。
涉及免疫系统的所有要素：淋巴细胞对于假丝酵母菌的细胞介导免疫和防止定植是必要的。中性粒细胞和单核细胞通过破坏假菌丝和芽生孢子干扰假丝酵母菌的繁殖。因此，中性粒细胞功能障碍或白细胞减少的患者有患侵袭性假丝酵母菌病的风险。这可能会导致急性播散性假丝酵母菌病，其特点是弥漫性出血和丘疹性皮疹及小血管血管炎，并伴有多器官受累（如肺、胃肠道、肝脏、脾脏、肾脏等）。急性播散性假丝酵母菌病病死率较高，常常在尸检时看到。因化疗引起的中性粒细胞减少的患者可能伴有慢性播散性假丝酵母菌病。功能性中性粒细胞的再次出现导致形成多个脏器的实质病变，影像学检查可对其加以评估。这些患者经常出现右上腹痛、发热及碱性磷酸酶升高，诊断通常需要进行活检。最后，补体和免疫球蛋白在调理和细胞内杀灭病原体过程中发挥重要作用，缺乏这些分子可能会导致难治性感染。
侵袭性酵母菌感染也已成为医院感染的重要组成部分，尤其是给重症及ICU患者的预后和生命安全带来巨大的威胁。
免疫力受损或下降。侵袭性假丝酵母菌病多见于免疫功能低下患者，患病率为2.1-21/100000，病死率为40%~60%。侵袭性假丝酵母菌病以白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌最为常见，白假丝酵母菌占65%~70%，但近年来在ICU、血液系统恶性肿瘤、实体器官移植等患者中，非白假丝酵母菌所占比例高于白假丝酵母菌。我国一项67所医院ICU的前瞻性调查研究结果显示：ICU侵袭性假丝酵母菌病的发病率为0.32%，白假丝酵母菌为主（41.8%），其次为近平滑假丝酵母菌（23.8%）、热带假丝酵母菌（17.6%）和光滑假丝酵母菌（12.3%）。中国医院侵袭性真菌病监测网 （China Hospital Invasive Fungal SurveillanceNet，CHIF-NET）一项65所医院5年8829株假丝酵母菌资料显示，4种最常见假丝酵母菌依次为白假丝酵母菌（44.9%）、近平滑假丝酵母菌复合群（20.0%）、热带假丝酵母菌（17.2%）、光滑假丝酵母菌复合群（10.8%）[5]。
2009年日本发现了耳假丝酵母菌（耳念珠菌，C. auris），现五大洲均分离出菌株。因其多重耐药，与院感爆发相关、病死率高而引起全球范围极大关注[6]。我国也已有18例耳假丝酵母菌感染的报道，病死率60%。截至2020年3月31日，美国各州报告的耳假丝酵母菌临床病例总计为1092例。其中，纽约州确诊496例，疑似4例；伊利诺伊州确诊310例，疑似4例；加州、佛罗里达州等19个州均发现确诊病例，除上述报告的临床病例数外，还通过在16个辖区进行有针对性的筛查发现了另外2253例患者感染了耳假丝酵母菌。其感染危害性致近半数感染者都在90天内丧生（587病例的一组资料）[7]。
三、侵袭性假丝酵母菌病的诊断
侵袭性真菌病诊断标准由所致危险因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学检查4部分组成。根据真菌感染的可能性将诊断结果分为三个级别：确诊、拟诊和疑似（临床诊断）。
确诊（proven）：除了具备危险因素、临床特征和微生物证据以外，无菌组织标本的组织病理学、细胞学或直接镜检可见酵母或菌丝，或者无菌组织培养获得阳性结果。
临床诊断（probable）：既有危险因素，也有临床特征表现，同时还有微生物学诊断依据。
拟诊（possible）：既有危险因素，也有临床特征表现，但是没有真菌学诊断依据（包括微生物学检查和组织病理学检查）[8]。
注: 微生物学检查标本主要来自血浆、血清、痰液、支气管肺泡灌洗液、支气管刷标本、鼻窦抽取液和导管引流液。标本采集应根据相关指南，及时采集标本进行病原体检测。培养标本及时送检。避免标本污染。
（一）病原学检查方法
1. 分离培养方法：分离培养与鉴定。由于假丝酵母菌为人体开放腔道（如口腔或胃肠道）的常居菌，因此从痰或粪便标本中分离培养出假丝酵母菌不能作为确诊依据。来源于无菌体液标本如血液、脑脊液、腹水、胸水、关节腔积液等培养阳性，或活检组织标本培养阳性且伴有组织侵袭证据，可作为侵袭性假丝酵母菌病诊断的金标准。对于非无菌部位的标本，同一部位多次培养阳性或多个部位同时分离到同一种假丝酵母菌，也常提示有侵袭性假丝酵母菌病可能。对所有拟诊侵袭性假丝酵母菌病的患者均应做血液真菌培养，以提高培养阳性率。培养阳性分离菌株可采用Chromagar假丝酵母菌显色琼脂，APcandida、API32C和全自动微生物鉴定仪及配套试剂作菌种鉴定。近些年来，MALDI-TOF（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪应用广泛，部分品牌可准确鉴定耳假丝酵母菌，多数主流微生物鉴定系统在软件未升级到特定版本之前，尚不能正确鉴定。分子方法如PCR及AFLP等可进行检测。
2. 非培养方法：（1）直接镜检：可直接镜检的标本包括无菌体液、痰、尿、粪便、分泌物或脓液及活检组织等。显微镜检查找见卵圆形芽生孢子、假菌丝提示假丝酵母菌，真菌荧光染色、免疫荧光染色可以提高检测阳性率。无菌体液及组织标本显微镜检查找见真菌具有诊断意义，确定菌种需真菌培养鉴定，显微镜检查未找见真菌不能完全除外真菌感染。（2）抗原检测：白假丝酵母芽管单克隆抗体（Candida albicans germ tube antibody）免疫荧光显微镜检测白假丝酵母菌。（3）真菌细胞壁代谢产物检测：1，3-β-D-葡聚糖（1-3β-D-glucan，BDG）检测，用于假丝酵母菌血症（白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌及克柔假丝酵母菌等）、肺孢子菌、镰刀菌、组织胞浆菌、毛孢子菌等真菌感染的诊断、疗效监测及预后判断。虽然不具特异性，但能够提示侵袭性真菌感染可能性。较血培养能够早数天或者数周检测到侵袭性念珠菌病，缩短抗真菌治疗起始时间。一项研究比较了一种较新的实时PCR检测、1，3-β-D-葡聚糖测定和血培养诊断侵袭性假丝酵母菌病的能力，研究对象为55例侵袭性假丝酵母菌病患者（17例假丝酵母菌菌血症，33例深部假丝酵母菌病，5例两者皆有）和73例为对照的住院患者。在侵袭性假丝酵母菌病的诊断中，PCR比1，3-β-D-葡聚糖测定更敏感（80% vs 56%），但两者的特异性相当（70% vs 73%）。在假丝酵母菌菌血症的诊断中，PCR和β-D-葡聚糖测定的敏感性相近，但PCR检测深部假丝酵母菌病的敏感性更高（89% vs 53%）。PCR和1，3-β-D-葡聚糖测定在侵袭性假丝酵母菌病的诊断中都比血培养敏感。对于侵袭性假丝酵母菌病患者，血培养联合PCR或血培养联合β-D-葡聚糖测定的敏感性分别是98%和79%[9]。因此，如果将这两种非培养方法之一与血培养联用，检测侵袭性假丝酵母菌病的敏感性可能升高。
（二）组织病理学检测
通过组织或细胞化学方法在组织切片中找到病原菌假丝酵母菌，是确诊该菌感染的金标准，但病理学传统的检测技术敏感性不高，并且存在侵入性操作，有增加感染等并发症的风险， 因此不作为检测假丝酵母菌感染的首选方法。组织标本可以采用微生物培养的方法检测。
（三）宿主感染标记物检测
1. 抗体检测：目前尚未开发出用于诊断的特异且敏感的假丝酵母菌抗体测定方法。假丝酵母菌为正常菌群的一部分，健康人也有相应的抗体，因此会使抗体测定的特异性降低。另一方面，免疫抑制的宿主可能无法对假丝酵母菌感染产生强烈的抗体反应，导致这种检测在该高危人群中的敏感性降低。
2. 非特异性炎症标记物：非特异性炎症标记物包括：白细胞计数、白细胞介素、C反应蛋白、降钙素原等。
（四）影像学方法
影像学方法包括核磁成像、CT和超声检查等。
（五）血培养结合其他方法快速鉴定
通过对特定DNA片段进行测序使菌种鉴定可以发现少见菌及新菌种。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）通过将待测菌株的蛋白质谱图与数据库中已知真菌的参考谱图比对后可得出鉴定结果。
2014年，美国FDA批准将T2Candida试剂盒和T2Dx检测仪（T2Candida）用于检测一些细菌引起的血流感染，包括白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌。T2Candida能在3-5个小时内从血液样本中检测到这些病原体。T2Candida这种检测方法主要是根据核磁共振技术来检测血液或尿液中的目标物质含量以快速做出检测结果。使酵母细胞分裂，从而使其释放DNA，并能复制靶DNA，从而采用磁共振技术检测扩增的DNA。一项研究纳入了1801例患者，发现T2Candida的总体敏感性为91%，几乎将所有的阴性标本都正确归类为酵母菌检测阴性[10]。
（六）假丝酵母菌基因分型检测技术
脉冲凝胶电泳（PFGE ）、多位点酶电泳（MLEE）、随机引物扩增多态性（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性（AFLP）、单链构象多态性（SSCP）检测技术、DNA测序等技术用于菌株分型。
图1. 侵袭性假丝酵母菌病的诊断方法
四、假丝酵母菌的耐药监测
（一）遵循的标准
耐药的假丝酵母菌株通过抗真菌药敏试验确定，方法包括琼脂稀释法、纸片扩散法、E-test法、稀释法等。用于确定耐药菌株的方法是美国临床实验室标准协会（Clinical Laboratory StandardInstitute，CLSI）颁布的用于酵母的M60，以及隶属于欧洲临床微生物学与感染性疾病学会的欧洲抗菌药物敏感试验委员会（European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing，EUCAST）颁布的抗真菌药敏试验方案。这些方案在培养基种类和酸碱度、孵育温度和时间、接种菌量、终点判读标准和质量控制等方面都做了统一规定，使得按照这些方案进行的试验及其结果在不同时间甚至不同实验室之间具有可重复性和可比性，客观性强。如CLSI方案规定，试验用培养基为RPMI1640液体培养基，酵母菌的接种量为（0.5-2.5）×103CFU/mL，孵育温度为35℃，假丝酵母菌孵育时间为24h。每次试验前进行质量控制的菌株ATCC 22019及ATCC 6258，还包括4株参考菌株24小时和48小时肉汤稀释法MIC范围。该方案规定了阿尼芬净（anifungin）、卡泊芬净（anifungin）、米卡芬净（micafungin）、伏立康唑（voriconazole）、氟康唑（fluconazole）最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）进行的白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、季也蒙假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌等菌株敏感、中介、耐药判读的折点。伏立康唑、氟康唑无季也蒙假丝酵母菌的敏感、中介、耐药判读的折点。氟康唑无中介折点、有剂量依赖敏感的折点（susceptible-dose dependent，SDD），白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌的SDD取决于最大的血液药物浓度水平[11-15]。见表1。
目前尚无耳假丝酵母菌的药敏折点。美国CDC建议氟康唑≥32μg/mL、两性霉素B≥2μg/mL（Etst≥1.5）、阿尼芬净≥4μg/mL、米卡芬净和卡泊芬净≥2μg/mL[16]。
抗真菌药物敏感流行病学折点（Epidemiological cutoff value, EVC）：指包含97.5%以上菌株在内的MIC值称为该药物的流行病学折点。CLSIM60未包括两性霉素、阿尼芬净、卡泊芬净、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、米卡芬净、泊沙康唑、伏立康唑的药敏折点，CLSI59发布了这些药物和少见假丝酵母菌的EVC[17]。见表2。
WS/T497-2017侵袭性真菌病临床实验室诊断操作规范，是引用Ｍ27-Ａ3、Ｍ27-S4制定的规范，增加了标本采集处理、标本形态检查、培养检查、真菌培养鉴定、非培养诊断方法、报告形式等内容。
（二）抗真菌药物的选择耐药现状
1. 天然耐药（固有耐药）克柔假丝酵母菌对氟胞嘧啶、唑类（azoles）存在天然耐药。
2. 获得性耐药：主要体现在假丝酵母菌对唑类抗真菌药的获得性耐药。白假丝酵母菌27所医院分离的148株白假丝酵母菌对氟康唑的敏感率为94.2%，剂量依赖性敏感（SDD）率4.4%，耐药率1.5%；对伏立康唑的敏感率为95.7%，中介率2.2%，耐药率2.2%。白假丝酵母菌对卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%。血液标本中共分离45株白假丝酵母菌，对氟康唑的敏感率为93.3%，SDD率4.4%，耐药率2.2%；对伏立康唑的敏感率为91.1%，中介率6.7%，耐药率2.2%；对卡泊芬净、阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%。儿童专科医院分离的10株白假丝酵母菌对氟康唑的敏感率为90.0%，SDD率10.0%；对伏立康唑的敏感率为90.0%，中介率10.0%；对卡泊芬净、米卡芬净、米卡芬净的敏感率均为100%。
近平滑假丝酵母菌 27所医院分离的84株近平滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感率为98.8%，SDD率1.2%；对伏立康唑的敏感率为98.8%，中介率1.2%。近平滑假丝酵母菌对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率均为100%。4所儿童专科医院分离的23株近平滑假丝酵母菌对氟康唑的敏感率为95.7%，SDD率4.35%；对伏立康唑的敏感率为95.7%，中介率4.4%；对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率为100%。近平滑假丝酵母菌平均分离率约17%，发生率已排名第二。
热带假丝酵母菌 27所医院分离的55株热带假丝酵母菌对氟康唑的敏感率为45.45%，SDD率12.73%，耐药率41.82%；对伏立康唑的敏感率为47.27%，中介率12.73%，耐药率40.0%。热带假丝酵母菌对卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净的敏感率均为100%。在全国监测中的分离率与近平滑假丝酵母菌相近（17%），但目前该菌种对氟康唑的耐药率以及不同唑类药物的交叉耐药率已从2010年的６%增至21%，唑类不敏感率已超过40%。
光滑假丝酵母菌 27所医院分离的33株光滑假丝酵母菌对氟康唑的SDD率93.9%，耐药率6.1%。光滑假丝酵母菌对阿尼芬净、米卡芬净的敏感率为100%，对卡泊芬净的敏感率为97.0%、耐药率3.0%[5]。
耳假丝酵母菌在美国受到重视，原因之一是美国分离的菌株体外药敏试验呈多重耐药，特别是对两性霉素Ｂ（amphotericin B）和棘白霉素类（echinocandins）耐药。我国耳假丝酵母菌感染仍为临床偶发案例、部分菌株对氟康唑耐药、未发现对两性霉素B耐药菌株和异常致病强的菌株[7]。
五、侵袭性假丝酵母菌病的治疗原则
应根据临床表现、诊断结果对侵袭性假丝酵母菌病实施选择治疗[8]。病原学结果对诊断和治疗有指导意义。
1. 经验治疗（empirical treatment）：主要针对疑似患者，在未获得病原学结果之前，考虑进行经验性治疗。药物的选择应综合考虑可能的感染部位、病原真菌、患者曾经用药的种类及药物有效性、安全性和效价比等因素。例如，就侵袭性假丝酵母菌病而言，粒细胞缺乏患者的首选药物为两性霉素B，对于非粒细胞缺乏患者，首选药物为氟康唑（患者未用过唑类药物）或两性霉素B（患者曾用过唑类药物）， 对于严重脓毒症或脓毒性休克患者，应首先采用卡泊芬净治疗。
2. 先发治疗（pre-emptive treatment）：主要针对拟诊患者。治疗方法与经验治疗大致相同。与经验治疗的区别在于：患者已具备微生物学检查阳性证据，但无组织病理学证据。对有高危因素的患者开展连续监测，包括每周2次胸部摄片、CT扫描、真菌培养及真菌抗原检测等。
3. 目标治疗：主要针对确诊患者, 依据真菌种类进行特异性抗真菌治疗。三种常见疾病的治疗方法如下：侵袭性假丝酵母菌病：对于白色假丝酵母菌或热带假丝酵母菌感染，首选药物为氟康唑，对于光滑假丝酵母菌或克柔假丝酵母菌感染，首选药物为两性霉素B或卡泊芬净。
综上所述，侵袭性假丝酵母菌病是患者防护性屏障受损和免疫力低下的结果，临床最常见的病原菌是白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌。耳假丝酵母菌易出现错误鉴定。快速诊断需要临床观察患者病情变化、机体的反应并借助检验、病理、影像学技术数据（图像）支持，各种技术的结合为准确快速提供了可能。假丝酵母菌耐药监测应遵循公认的标准和操作规范，操作过程注意质量控制，标本质量是检测准确的关键。
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