新型冠状病毒肺炎疫苗应用与中和抗体检测及POCT检 测技术应用价值

【摘要】新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情爆发以来，COVID-19疫苗的研发迅速，有希望成为疫情防控的关键手段。中和抗体检测是对于疫苗有效性评估的至关重要，而传统中和抗体检测因耗时长、检测条件要求较高、生物安全风险较高等因素，难以有效满足快速、大范围检测的需求，而基于病毒颗粒和假病毒等中和抗体替代性中和抗体检测，可在一定程度上推动中和抗体检测的广泛应用。同时，以现场即时检测（POCT）为基础的抗体快速检测技术，依托其快速、便捷、对于检测条件和人员适用性强等特点，也有希望为COVID-19上市后的受试者评估提供辅助参考。

自2019年底，新型冠状病毒肺炎（COVID-19）首次被报道以来迅速席卷全球，几乎对于全球所有国家都造成较大影响。截止北京时间10月18日，全球累计确诊病例39196259例，累计死亡1101298例，并且近期在欧洲、美洲等地区COVID-19的发病率呈现反弹趋势^[1]。虽然瑞德西韦被美国食品药品管理局（FDA）批准为治疗COVID-19的药物，其对于COVID-19患者康复时间有所缩短，但未能有效降低死亡率^[2]，在COVID-19患者治疗方面尚未有特效药物。而目前新型冠状病毒疫苗研发进度迅速，有望成为疫情防控的重要手段。中和抗体检测作为疫苗有效性评价的主要方式，在随之到来的全球COVID-19疫苗大范围应用中将扮演重要角色，同时在快速、便捷、可靠等方面也面临更高的要求。

一、COVID-19疫苗全球研发现状

疫苗研发需经历实验室研制、临床前研究、I、II、III期临床试验，在一般情况下疫苗由研发到上市应用也需要2-5年时间^[3]。而在本次COVID-19疫情中，由于疫情的急迫性，疫苗的研发进度明显加快，截止2020年10月19日，据WHO统计全球总计有10款COVID-19疫苗进入III期临床试验（表1），进行最后的大规模人群验证，其中有4款疫苗来源于中国厂商。预计COVID-19疫苗最快有望在2020年底2021年第一季度上市应用。

表1. 目前全球进入III期临床试验的新型冠状病毒疫苗

SARS-CoV-2主要包括四种结构蛋白，分别为刺突蛋白（S）、基质蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。其中S蛋白以同源三聚体形式存在，其单体可被蛋白酶识别并切割成S1和S2亚基，S1主要包含一个受体结合域（RBD），RBD识别细胞表面受体，并与其结合，S2亚基介导病毒包膜和细胞膜融合。目前认为，与SARS-CoV类似，阻断SARS-CoV-2的S蛋白或其RBD蛋白与受体结合有助于阻断病毒侵入^[4、5]，其也是COVID-19主要采用的目标靶点。

参照SARS-CoV、MERS-CoV的研究经验，有效的疫苗接种后可诱导有效的B细胞应答产生抗体和激发特异性、有效的T细胞免疫应答^[6]。其中由B细胞产生的中和抗体尤为重要，其可阻止病毒与细胞受体的结合而阻止病毒进入细胞。所以，有效的疫苗应可同时激发中和抗体及特异性T细胞应答，在目前新冠病毒疫苗临床试验中，中和抗体检测也成为对于疫苗有效性的主要评价指标。

另外，由于较为快速的疫苗研发与验证，对于疫苗的安全性评估需要严格要求，例如虽目前未见发现，但需警惕抗体依赖性增强（ADE），ADE指由于产生中和抗体浓度或亲和力差，有可能造成病毒感染时其复制和感染能力显著增强，在呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗临床试验期间曾出现ADE^[7]。另外，疫苗接种后的中和抗体高水平存在时间多长，可提供对久的保护等问题，也有待进一步后续明确。这些方面也需要通过中和抗体检测提供有效支持和依据。

二、新型冠状病毒中和抗体检测

机体可能产生数百或数千种不同的抗体变体来对抗包括病毒在内的任何病原体或外来物，这会导致个人和人群中的抗体具有广泛的多样性。有些抗体比其他抗体更能阻止病毒入侵。当一种抗体有效地使得病毒无法感染细胞，这种抗体就是所谓的“中和抗体”，其作用机制是通过与相应抗原特异性结合，从而直接发挥中和或阻断作用。

对于中和抗体检测，包括病毒中和试验、酶标记方法、抗原-抗体间接凝集抑制试验等方法^[8]。病毒中和试验是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后残存感染力为依据进而判定免疫血清中和病毒能力的方法，其为WHO认定的目前检测中和抗体的参考方法，但是该实验不仅耗时、花费较贵，而且还需要很好的实验室设备以及技术人员和活病毒，而有些病毒传染性强、致死率高或不能进行体外培养，无法通过在体外观察细胞病变效应抑制的方法进行中和抗体检测。而随着病毒样颗粒（VLP）或假病毒替代性中和抗体检测技术完善，并可依托ELISA等酶标记平台，相对安全、便捷及快速，也逐步成为重要的检测手段，例如HPV假病毒中和抗体检测技术已作为“金标准”应用于临床血清样本检测和疫苗免疫原性的研究^[9]。但同时替代性中和抗体检测也存在检测抗体不一定真实反映待测样本中和抗体水平等方面局限。

对于COVID-19疫苗，大多采用传统病毒中和试验对于中和抗体水平准确计量。但因SARS-CoV-2的高传染性和传统方法耗时较长，一些相对安全、快速的替代性中和抗体检测方法也逐步建立。例如美国杜克大学医学院和新加坡国立大学Duke-NUS联合新发传染病研究所开发出一项基于竞争性ELISA的中和抗体检测试剂，以病毒表面蛋白（S-1）和人体受体蛋白（ACE-2）之间的特异性蛋白结合抑制为检测基础，在临床验证中其灵敏度为95%-100%，特异性为99.93%^[10]。并且有多个研究机构成功研制出假病毒，进一步为COVID-19中和抗体快速、便捷检测的开展提供支持^[11、12]。

三、POCT与中和抗体检测

以SARS-CoV-2抗体/抗原快速检测为代表的现场即时检测（POCT）技术在COVID-19疫情防控中扮演了重要角色。COVID-19抗体POCT检测可10-15分钟内报告结果、操作便捷、对于检测条件和检测人员适用性高等特点，尤其适合医疗资源相对匮乏地区应用开展。而在COVID-19疫苗即将全球性应用的情况下，尤其是对于资源匮乏地区，基于POCT技术辅助中和抗体评估可在一定程度上为COVID-19疫苗接种受试者评估的广泛快速开展提供支撑。

虽然目前尚未有基于POCT技术的SARS-CoV-2中和抗体检测试剂上市，但万孚生物等POCT领域厂商已开始着力于中和抗体定量快速检测试剂的开发。另外，对于可能面临COVID-19疫苗上市后广泛应用带来的中和抗体检测能力不足的情况，现有定量COVID-17抗体POCT检测技术也有希望提供一定程度的参考依据。一些研究提示，以S蛋白为靶点的COVID-19抗体POCT检测对于中和抗体评估具有一定替代性快速评估价值。例如有研究通过在COVID-19患者和康复者中，进行COVID-19抗体POCT检测和传统中和抗体检测对比，发现POCT检测抗体水平与传统方法中和抗体水平高度相关，对于中和抗体水平具有快速指示价值[13]。随着后续对于POCT检测在COVID-19疫苗受试者中中和抗体评价循证医学证据完善，以S蛋白为靶点的POCT抗体检测技术，有希望成为COVID-19疫苗应用过程中的重要辅助参考手段。

小结：在COVID-19全球流行的情况下，COVID-19疫苗的快速研发对于疫情防控具有重要价值。同时，在疫苗研发和应用过程中，中和抗体检测对于疫苗有效性和疫苗研究完善扮演关键角色。而基于POCT技术的抗体检测因其便捷、快速、适应性，也有望在COVID-19全球广泛应用过程中提供快速中和抗体评估支持，促进疫苗安全有效应用。

参考文献

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