新型冠状病毒抗体检测试剂的研发与应用

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情爆发至今，国内疫情已趋于平稳，但零星散发病例和局部暴发疫情的风险仍然存在，且国际疫情形势依然严峻。尤其进入秋冬季，流感高发，有可能与新冠叠加，从而增加疫情的复杂性。因此，对新型冠状病毒（2019-nCoV）进行准确检测，及时识别感染人群，是疫情常态化防控的重要举措，对维护和保障人民健康具有重大意义。

目前，各国对新冠病毒的检测方法集中于病原学检测和血清学检测两类^[1-2]。核酸检测和抗原检测属于病原学检测，通过直接检测新冠病毒病原体的核酸、抗原，从而为明确诊断提供重要依据。抗体检测则属于血清学检测，这是一类间接检测技术，利用抗原与抗体特异性结合的原理，可在体外通过特定的重组抗原（或假病毒）来检测血液样本中抗体的存在，从而间接证明人体中含有新冠病毒。血清学检测是对病原学检测方法的有力补充与协同。根据国家药品监督管理局（NMPA）数据，截至2020年11月5日，国内共批准新冠病毒核酸检测试剂24个，抗体检测试剂25个，抗原检测试剂2个。本文将以具体产品为例，主要就新冠病毒抗体检测作相关介绍。

一、抗体检测的意义和类型

当病毒等病原体侵入机体，可引发机体的免疫应答，而抗体是体液免疫应答中的重要效应分子，可特异性识别并结合外来抗原，并启动下游的效应细胞和分子发挥作用以清除外来抗原。抗体种类主要有IgM、IgG、IgA、IgE、IgD等。一般而言，急性病毒感染后首先产生IgM抗体并迅速达到高峰，但维持时间较短；IgG抗体主要在感染中后期产生，疾病恢复后其滴度仍可在高水平持续较长时间，在抗体介导的抗感染免疫中起主要作用；IgA主要参与粘膜免疫，IgE则主要介导超敏反应，而IgD的功能尚未完全明确。

依据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》^[3]，“新型冠状病毒特异性IgM抗体阳性”可作为疑似病例诊断依据之一；“新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性”或“新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期IgG抗体滴度较急性期呈4倍及以上升高”可作为确诊病例的依据。一般不单独以血清学检测作为诊断依据，需结合流行病学史、临床表现和基础疾病等情况进行综合判断。对于临床怀疑新冠肺炎且核酸检测阴性的患者，以及病情处于恢复期且核酸检测阴性的患者，则可通过抗体检测进行诊断。

值得注意的是，机体免疫应答受病原体的致病能力和机体的免疫功能等因素影响，不同患者的特异性抗体出现时间和表达水平存在个体差异。因此，试剂的检出率与被检测人产生抗体的个体差异以及病程阶段都相关。相关研究及临床实践表明，新冠病毒抗体在患者体内血清中位转换时间在10天左右，因此在新冠患者发病一周内新冠病毒特异性抗体检测的阳性率较低。

血清学抗体检测，无需对患者进行咽拭子采样，可降低医护人员暴露风险，适合在突发疫情中应用。尤其是即时检测（POCT）类的抗体检测试剂，可突破检测环境和人员的限制，为患者的诊断和管理提供便捷、经济的解决方案。

目前国内获批的新冠病毒抗体检测试剂采用了不同的方法学，包括胶体金法、化学发光法、酶联免疫法、荧光免疫层析法等。其中基于胶体金法的抗体检测试剂是最典型的POCT产品，具有检测快速、操作简单、试剂稳定等特点，标本无需特殊处理，也无需配套仪器，15分钟即可通过肉眼观察获取检测结果。基于荧光免疫层析法的抗体检测试剂亦属于POCT产品，其以荧光物质为标记物，如荧光微球、量子点、稀土纳米材料等，相比胶体金法具有更高的灵敏度，但需要配合专门的仪器使用。

根据检测目标物的不同，新冠病毒抗体检测试剂可分为以下几种：① 仅检测新冠病毒特异性抗体IgM的抗体检测试剂；② 仅检测新冠病毒特异性抗体IgG的抗体检测试剂；③ 联合检测新冠病毒特异性抗体IgM和IgG的IgM/IgG抗体检测试剂；④ 不区分特异性抗体种类的（总）抗体检测试剂。

二、代表性检测试剂介绍

1. 新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（胶体金法）：2020年2月22日，广州万孚生物技术股份有限公司的新型冠状病毒（2019-nCoV）抗体检测试剂盒（胶体金法）获国家药监局新型冠状病毒应急医疗器械审批批准，成为首批正式获准上市的新冠病毒抗体POCT检测试剂，为疫情防控提供了良好的助力。

该试剂盒采用免疫层析技术原理，应用捕获法体外定性检测人血清、血浆、静脉全血中的新冠病毒抗体。检测时，当样本中含有新冠病毒抗体且浓度高于或等于最低检出限时，抗体与抗原标记物结合，被检测区（T）二抗（抗μ链抗体/抗人IgG抗体）捕获，形成红色反应线，此时结果判为阳性；反之则不显带结果判为阴性。正常检测情况下，质控区（C）均应显色，以指示该次检测有效。

胶体金法的抗体检测试剂，虽然检测灵敏度可能较化学发光法、酶联免疫法低，但该方法操作简单，成本低廉，能够突破场地和操作人员的限制，广泛应用于各级医疗卫生机构，推动诊断前移、下移。且该试剂同时检测新冠病毒特异性IgM和IgG抗体，不对两者进行区分，能对疑似病例更有效评估。姜中毅等^[4]使用了三种不同检测原理的新冠病毒抗体检测试剂盒（包括两种胶体金法试剂和一种磁微粒化学发光法试剂），对33例新冠确诊病例的58份血清标本和100份健康人的血清标本进行了病毒特异性IgM、IgG和总抗体检测。结果显示，IgM抗体的总阳性率在48.2%～56.9%之间，IgG抗体总阳性率在48.2%～55.2%之间，总抗体阳性率为56.9%。

Jeffrey D. Whitman等^[5]对12种新冠病毒抗体检测试剂进行了评估，包括10种胶体金法试剂和2种酶联免疫法试剂。其中，万孚生物新冠病毒抗体检测试剂（胶体金法）特异性为99.1%，且对于大多数发病时间段患者均具有较优的灵敏度。在12种试剂中，仅有4种试剂对发病16天以上的患者阳性检出率高于80%且同时保持95%以上的特异性，万孚试剂为其一。

Silvia Figueiredo Costa等^[6]采用同款万孚试剂对122例新冠确诊病例的血清/血浆标本进行了抗体检测，灵敏度为85.8%，其中对发病14天以上的患者阳性检出率高达94.9％。122例确诊病例中，有16例临床诊断病例的RT-PCR结果呈阴性，使用万孚试剂检出15例阳性，证实抗体检测可用于核酸检测阴性患者的诊断。

2. 新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法）：在新冠病毒特异性抗体IgM、IgG联合检测方面，万孚生物基于荧光免疫技术平台开发了新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM/IgG抗体检测试剂盒（荧光免疫层析法），目前已获欧盟CE认证。

该试剂采用荧光免疫层析技术，体外定性检测人血清、血浆、静脉全血样本中的新冠病毒IgG和IgM抗体。检测时，将待测样本加入样本稀释液中混匀，将混合样本滴加至加样孔中，样本中的待测物与标记垫上的荧光标记2019-nCoV抗原结合形成反应复合物。由于层析作用，反应复合物沿着硝酸纤维素膜向前移动，T1检测区包被了抗人IgM抗体，可捕获样本中的2019-nCoV IgM抗体，当样本中的2019-nCoV IgM抗体浓度越高，免疫荧光检测仪扫描的信号值越高，则样本中IgM阳性程度越强，此时对应的IgM抗体检测结果为阳性。T2检测区包被了抗人IgG抗体，可捕获样本中2019-nCoV IgG抗体，当样本中的2019-nCoV IgG抗体浓度越高，免疫荧光检测仪扫描的信号值越高，则样本中IgG阳性程度越强，此时对应的IgG抗体检测结果为阳性。质控区（C）包被鸡IgY多克隆抗体，与荧光胶乳标记的羊抗鸡IgY多克隆抗体反应形成具有一定信号值的反应线作为质控。

该试剂配套万孚免疫荧光检测仪（FS113）或干式荧光免疫分析仪（FS205、FS301）使用，可满足不同通量以及检测场景的需求。例如采用20通道的FS30飞测全自动免疫荧光定量检测仪，可实现仪器全自动穿刺取样，无需开盖，达到“样本进-结果出”，有效降低检验室密闭空间内医护人员接触传播及气溶胶传播风险。该试剂10分钟即可出具结果，且借助仪器避免肉眼判读结果带来的误差，检测结果可靠准确，符合常态化疫情防控所需，具有较高的临床应用价值。

综上所述，以免疫层析法为代表的抗体快速检测适宜于疫情突发状况，满足疫情防控对于操作便捷、检测条件和人员要求较低、易于普及等需求。在临床应用中与核酸检测补充或协同使用，可以有限提高检出率，更加有效指导临床救治工作。并且在特定的国家或区域、现场检测、流行病学抽查等场景以及大通量普查等方面抗体检测具有不可替代的作用。

在POCT领域，万孚生物始终走在前列，快速响应开发产品，除了新冠病毒抗体检测试剂全国首批获证之外，2020年11月3日，万孚生物新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）亦是全国首批获得注册证，可作为现有检测方法的补充。在政府、医疗机构、厂家等各方面的共同努力下，国内不断丰富新冠病毒检测试剂类型，扩大试剂供应，持续服务疫情防控的需要。

参考文献

1. Carter L J, Garner L V, Smoot J W, et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis[J]. ACS Central Science, 2020, 6: 591-605.

2. Udugama B, Kadhiresan P, Kozlowski H N, et al. Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection[J]. ACS nano, 2020, 14(4): 3822-3835.

3. 中华人民共和国国家卫生健康委员会. 关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）的通知（国卫办医函〔2020〕145号）[EB/OL]. http://www.nhc.gov.cn/xcs/zhengcwj/202008/0a7bdf12bd4b46e5bd28ca7f9a7f5e5a.shtml.

4. 姜中毅, 毛乃颖, 朱贞,等. 基于三种试剂盒分析新型冠状病毒特异性抗体的动态变化[J]. 病毒学报, 2020, v.36(03):7-11.

5. Whitman J D, Hiatt J, Mowery C T, et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance[J]. Nature biotechnology, 2020, 38(10): 1174-1183.

6. Costa S F, Buss L, Espinoza E P S, et al. Performance of a qualitative rapid chromatographic immunoassay to diagnose COVID-19 in patients in a middle-income country[J]. Journal of Clinical Virology, 2020, 131: 104592.