侵袭性真菌感染的实验室诊断技术以及面临的挑战

作者：郁谨菡  黄晶晶  肖盟  徐英春

【摘要】侵袭性真菌感染（Invasive fungal infection，IFIs）具有较高的发病率和死亡率，尤其在免疫系统受损的患者中，如血液恶性肿瘤患者、造血干细胞移植（HSCT）患者、实体器官移植（SOT）患者，以及重症监护室（ICU）的危重症患者。早期诊断与真菌感染预后息息相关。传统的真菌病诊断方法包括临床样本直接镜检、培养和组织病理学诊断。一些新的诊断方法包括抗原检测、分子生物学和基于蛋白质组学的诊断方法也逐渐被用于真菌病的诊断。这些新的方法显著提高了疾病的早期诊断水平。本文旨在对目前侵袭性真菌感染的实验室诊断技术以及临床研究的问题和现状给予总结，拟从诊断方法学角度对真菌病诊断进行概述。

【关键词】侵袭性真菌感染；真菌病；早期诊断；实验室诊断技术

真菌感染性疾病导致全球超过150万人死亡，影响了十亿多人^[1]，早期诊断从而尽早治疗对侵袭性真菌感染（Invasive fungal infection，IFIs）的预后至关重要。多种病原学诊断技术可助力侵袭性真菌感染的诊断，但应用场景及结果的临床意义存在一定差异。本文旨在对目前侵袭性真菌感染实验室诊断技术以及临床研究的问题和现状进行概述。

一、传统诊断方法

直接镜检法通常取疑似真菌感染的毛发或皮屑、脓液、脑脊液、痰等作为标本。非染色标本在滴加10%氢氧化钾（KOH）溶液后即可湿片检查；需染色标本可根据需要采用乳酸酚棉蓝染色、革兰染色、瑞氏染色、荧光染色或墨汁负染色（可作为诊断隐球菌感染的金标准）、吉姆萨染色法（可用于诊断组织胞浆菌和马尔尼菲篮状菌感染）以清晰观察菌丝、孢子和荚膜等结构。镜检法可以对样本中有无真菌做出快速判断，比培养更快速、简单，成本也更低。但镜检结果为主观判断，且对检验技术要求高，其阴性并不能明确排除真菌感染^[2]。

真菌培养法是侵袭性真菌感染诊断的“金标准”，也是后续进行药物敏感性试验的前提。欧洲医学真菌学联盟和真菌病研究组教育与研究联合会认为，培养是菌种鉴定的关键，强烈建议真菌培养用于种属鉴定和药敏试验，注意培养标本避免组织匀浆操作^[3]。然而，培养法常需要结合菌落特征、生化试验等进行详细观察，耗时长，甚至需要数天重复多次接种才能得出可靠结果，且敏感性和阳性率较低，对操作人员的技术经验要求高，不利于早期诊断^[2]。

组织病理学检查是诊断IFIs的最高标准^[4]。在组织病理学检查发现真菌成分时，通过PCR联合DNA测序可进一步鉴定真菌菌种^[5]。西班牙一项研究^[6]，在132例培养阴性但组织病理学检查确诊IFIs的患者中，PCR检测到28种不同真菌，且同时还检测到多种新发或罕见菌株。应当注意的是组织病理学诊断的灵敏度取决于标本的质量，如果取材自非无菌部位，则无法确定是否为感染^[2]。采用侵入性方法从无菌部位获取标本，对血小板减少和凝血功能异常以及其他类型的危重患者并不适用, 在国内也时常不被为患者及家属接受。

二、血清学诊断技术

真菌感染的血清学诊断大致可分为抗原检测（G试验、Mn试验、GM试验、GXM试验等）和抗体检测两类。血清学检测可以提供早期诊断，对传统诊断方法和分子生物学等诊断方法进行补充和验证。

G试验的检测靶标是真菌细胞壁的非特异性结构成分，即（1-3）-β-D-葡聚糖（(1-3)-β-D-glucan，BDG），主要作为泛真菌筛查技术为国内外指南所推荐^[7-9]。建议G试验在诊断侵袭性念珠菌病时采用80pg/mL作为阳性界定值^{[5, 9]}。既往研究报道提示：连续2次G试验检测，且阈值为80pg/mL时诊断高危患者侵袭性念珠菌病的准确率较高^[10]。在适当的环境中，针对以下患者，G试验检测可作为诊断IFIs的依据：1）伴或不伴有中性粒细胞减少症的血液系统恶性肿瘤患者；2）造血干细胞移植术后中性粒细胞减少患者；3）ICU中侵袭性念珠菌病（发生率＞10%）高危患者，因消化道手术导致反复吻合口瘘、上消化道穿孔患者或临床疑似感染的坏死性胰腺炎患者^{[11, 12]}。应当注意，新型隐球菌和接合菌属（如毛霉菌、根霉菌）感染并不能在血及脑脊液中测到BDG ^[13]。此外，G试验也不能作为任何侵袭性霉菌病的真菌学证据^[5]。

Mn试验的检测靶标是念珠菌细胞壁的主要成分，即甘露聚糖（manan，Mn）。在2012年念珠菌感染诊疗指南中，欧洲临床微生物与感染性疾病学会（ESCMID）推荐Mn试验用于念珠菌血症、侵袭性念珠菌病、慢性播散性念珠菌病（CDC）的诊断。研究发现，在CDC诊断中，相比培养法平均提早16天确诊^[9]。但其诊断的敏感性较低，尤其是针对近平滑念珠菌和季也蒙念珠菌^[14]。

GM试验的检测靶标是半乳甘露聚糖（galactomannan，GM），是国内外指南推荐的侵袭性曲霉感染检测试验，是早期诊断曲霉感染的有效指标^[15]。利用单克隆抗体EB-A2的双夹心酶联免疫吸附法已被美国食品和药物管理局（FDA）批准用于检测血清和支气管肺泡灌洗液^[16]。值得注意的是，GM试验的敏感性和特异性与阳性界定值密切相关^[5]，抗真菌药物的使用会降低GM试验的敏感性^{[17, 18]}。

GXM试验的检测靶标是葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖（glucuronoxylomannan，GXM），即隐球菌的荚膜多糖主要成分，是隐球菌的特异性生物标志物。研究表明，胶体金免疫层析法检测荚膜多糖抗原的灵敏度及特异性均可达98%-100%^{[19, 20]}。中华医学会感染病学分会于2018年5月发布《隐球菌性脑膜炎诊治专家共识》^[21]，胶体金免疫层析法因其简单、快速，已成为目前国内临床上诊断隐球菌感染最常用的方法之一。然而，标本类型仅限于血清和脑脊液；溶血标本会使检测系统背景颜色变深导致出现假阴性；样本浓度不能高于0.140mg/mL，否则会出现高剂量钩状效应。

IFIs伴随着真菌特异性抗体的产生，定植患者检测不到特异性抗体，据此可区分感染与定植。相比真菌抗原的检测，特异性抗体的检测相对滞后，但抗体的不同类型代表感染的不同阶段，多与其他血清学检测联合使用。指南推荐抗甘露聚糖抗体联合Mn试验作为特异性检测念珠菌感染的方法^[9]，曲霉IgG抗体检测和肺泡灌洗液GM试验用于慢性肺曲霉病诊断^[22]。

近年来，科研工作者根据酶联免疫吸附试验的原理，建立了一种体外特异性抗原刺激淋巴细胞，检测特异性抗体分泌细胞数量和功能的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT），后将该技术发展为评估单细胞水平分泌特定细胞因子的功能和细胞数量。目前，ELISPOT技术已经成功应用于结核菌病的诊断，有望应用于真菌感染的诊断^[23]。此外，Alexander BD等[24]利用从真菌提取的天然抗原，成功建立了多种地方性真菌病血清学检测方法，用于包括芽生菌病、球孢子菌病，副球孢子菌病和组织胞浆菌病的早期诊断及流行病学调查，并显示出较高的敏感性和特异性。

三、分子生物学等新型诊断技术

无论是传统诊断方法还是血清学检测，均无法实现菌种鉴定、定量检测、高通量检测、耐药位点检测等。随着分子生物学和生物传感器技术的不断发展，以聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）为代表的核酸诊断，可以不进行纯化培养直接应用于临床标本，给临床真菌病诊断领域带来了新的契机。

1. 聚合酶链反应：基于聚合酶链反应的基因扩增技术作为多种分子生物学诊断方法的基础被广泛应用于真菌感染诊断中。PCR技术应用于真菌感染诊断的传统策略是，先使用较为保守的引物（例如：全真菌引物、全念珠菌引物、全曲霉引物等）检测是否存在真菌感染，然后再使用属或种特异性引物（可以进行多重PCR，即在一次检测中同时对多个菌种进行检测和鉴定）或采用其他诊断技术（例如：测序或者限制性酶切分析）进行精准诊断^{[25, 26]}。即将DNA放大数百万倍后再进行测定，可以简便、快速地鉴定多种医学重要真菌，广泛应用于病原真菌的分型、鉴定和亲缘关系的研究。

最常见的PCR采用热循环技术，若在整个扩增过程仅利用单一温度处理，则为等温扩增，不依赖复杂仪器或热稳定聚合酶。等温PCR因仪器便携且成本更低，使得PCR可以更好用于低收入和基础设施落后的地区。例如，环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60～65℃），经一个步骤即可完成。其扩增效率极高，而且可以通过肉眼判断靶基因是否存在^{[25, 27, 28]}；依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，NASBA）通常在41℃下以RNA为模板进行等温扩增并能实时观测结果，特异性强、灵敏度高、不易被污染；而滚环扩增（Rolling Circle Amplification，RCA）技术可以将目标基因扩增到109以上，几乎不需要优化，并且不担心污染问题，解决了其他PCR技术的主要问题^[29]。值得注意的是，PCR还可以直接从临床标本中识别与三唑耐药相关的某些突变^[30-32]。曲霉菌PCR能够区分曲霉的属和种，可用于成人血液系统恶性肿瘤和HSCT的评估^[5]。

2. 质谱技术：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术是基于培养的分子生物学诊断方法，对真菌细胞裂解产物的全蛋白进行检测，根据蛋白质序列指纹图谱的匹配度，得出鉴定结果和相应的评分。具有操作简便、高灵敏性、高特异性、高准确度和高通量等特点。相比DNA测序更为快捷，且不依赖于通用引物的扩增，更能满足临床需求。但在真菌鉴定方面，该方法还存在诸多问题，如丝状真菌蛋白提取困难、指纹图谱数据量有限、鉴定前培养条件仍需标准化、检测未标准化等^[33]。此外，电喷雾电离质谱法也可应用于真菌鉴定，不需要临床预判。然而成本较高且存在扩增子污染的问题^[34]。

3. 测序技术：随着公共数据库（例如GenBank）信息的不断丰富，DNA测序成为非常有价值的诊断工具。扩增核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）的通用引物是鉴定病原真菌最常用的引物。通用引物PCR联合测序的方法可以很好的对病原真菌进行鉴定。除ITS序列外，核糖体26S/28S大亚基的D1/D2区域也具有一定的诊断价值。但不具有ITS区域诊断敏感性，在许多情况下只能实现属水平的鉴定^[35]。针对培养阴性的IFIs患者，测序技术可以用于明确致病菌，有助于早期诊断、指导临床用药，同时明确发病机制^[36]。然而，由于GenBank具有开放性特点，需要使用者具备生物信息学和真菌学专业知识以便准确筛选出较好的真菌信息^[37]。

一代测序技术，即双脱氧链终止法Sanger测序，读长可达1000bp、精确度高达99.999%，但测序通量低、成本高等缺点限制了它的大规模应用。二代测序技术（Next-generation DNA sequencing，NGS）采用边合成边延伸边测序的核心思想，不依赖于传统培养法，也无需特异性扩增，可直接对临床样本中的核酸无差别、无选择性地进行高通量测序，与已知真菌序列数据库进行比对分析^[38]。临床微生物实验室常以MALDI-TOF MS技术辅以Sanger测序进行菌种鉴定^[39]。但Sanger测序获得的菌株信息有限，且临床对于微生物实验室的需求不仅仅局限于菌种鉴定和药物敏感性检测，实验室常常需要协助感染控制部门进行感染性疾病暴发的调查，在分子水平监测耐药性的传播。因此，及时、有效开展NGS测序是临床微生物工作必不可少的内容。目前，NGS也存在局限性，技术水平较高，存在去人源化难度大；真菌提取DNA相对困难等问题；缺乏统一、完善的检测流程和质量控制标准；结果无法区分定植菌和致病菌，暂时还无法同时得到抗菌药物药敏结果，检测费用较高等^[38]。

随着高通量测序技术的发展，出现以单分子测序为技术特点的第三代纳米孔单分子测序，使用纳米孔技术基于检测电导率的变化直接对核酸片段进行全长读取，从而进行长读长（10kbP以上）序列的高通量基因测序。该技术已被应用于真菌鉴定，极大地减少了前处理工作，解决了当前NGS的瓶颈。然而，纳米孔技术的错误率达12%-35%，准确性不如当前NGS平台^{[40, 41]}。此外，根据16S rRNA基因的高度保守性来检测病原菌的基因芯片技术，具有高效、高速，且能定量，重复测序的优点。但该技术不能测定未知物种，而且在定量方面较局限，成本也相对较高，限制了临床应用^[42]。

4. 杂交技术：荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种可视化特定DNA序列的分子细胞遗传学技术，其基本流程包括探针标记、探针的变性、样本变性、杂交和荧光信号采集。核酸肽-荧光原位杂交利用荧光标记的特异核酸类似物探针与真菌细胞内相应的靶标rDNA进行分子杂交，探测荧光信号达到检测的目的。研究显示，其对白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌的检测敏感度可达100%，近平滑念珠菌和热带念珠菌的敏感度为94%，特异性可达100%。目前，该技术难点在于探针如何高效通过真菌细胞壁和膜到达细胞内^[43]。

5. 核磁共振技术：2014年美国FDA批准了一种血液念珠菌感染快速检测平台T2Candida®，该技术可在3.4-5.4h内从患者全血标本中检测5种常见念珠菌。其原理是利用携带探针的磁性纳米颗粒识别PCR扩增后的病原体的ITS2靶序列，并与之杂交形成微颗粒。最后，采用核磁共振法检测形成的微颗粒。其敏感性和特异性分别达90%和98%以上，且阴性预测值极高，但其阳性预测值则随患者群体改变而变化^[44-46]。该方法检测的最小阈值可达1-3CFU/mL血液标本，不同种念珠菌的检测阈值、敏感性和特异性略有差异，但总特异性为99.4%，敏感性为91.1%。目前，T2 Candida检测已被列为真菌学证据，用于临床试验中念珠菌血症的诊断^[47]。

四、面临的挑战

在感染性疾病诊断领域，多学科合作是早期、快速诊断的关键，IFIs的诊断仍具有很大的挑战性。传统诊断方法对真菌感染的敏感性有限，其准确性取决于组织样本的采集效率，许多情况下由于其有创性, 在血小板减少和凝血功能异常以及其他类型的危重患者并不适用。在国内也时常不被为患者及家属接受。而血清学检测的技术难点在于：1）无法实现精确的菌种鉴定；2）易出现假阳性结果；3）不同循环抗体和抗原之间可能存在交叉反应。虽然基于核酸检测的方法有诸多优点，也仍受到很多方面的制约。如何高效提取临床样本中病原真菌核酸是分子诊断领域的研发关键和行业难点，也是真菌感染核酸诊断发展滞后的主要原因。其次，临床样本中病原真菌数量有限，真菌基因拷贝数并不多，亟需提高检测方法的敏感性。相信随着诊断技术的不断应用、改进和创新，将使未来真菌甚至整个微生物鉴定领域发生巨大变化，同时也促进对临床治疗和流行病学的研究。

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