非岩藻糖化的IgG表征包膜病毒反应与COVID-19的严重程度的相关性
【摘要】IgG抗体对于抵御入侵的病原体至关重要。IgG-fc尾部高度保守的n-链聚糖，对IgG功能至关重要，在人类中表现出不同的组成。非岩藻糖基化的IgG变异体已经用于抗癌治疗抗体，通过Fc受体（FcγRIIIa）提高活性。在这里，我们报道了非岩藻糖化IgG(约占人类总IgG的6%)是专门针对包膜病毒而形成的，但一般不针对其他抗原。这介导了更强的FcγRIIIa反应，但也放大了细胞因子风暴和免疫介导的病理。重症COVID-19患者（非轻症患者）存在高水平的非岩藻糖基化型抗SARS-COV-2 IgG抗体，放大促炎细胞因子释放和急性期反应。因此，抗体糖基化在对包括COVID-19在内的包膜病毒的免疫应答中发挥着关键作用。
长期以来，抗体的功能被认为是静态的，主要取决于其同型和亚类。在IgG的Fc域297位置存在一个保守的n-链聚糖，这对其效应功能至关重要(1-3)。此外，这种聚糖的组成是高度可变的，这有功能上的后果(2-4)。这对于Fc聚糖的核心焦点来说尤其如此。IgG的无核心岩藻糖化变体引起的发现升高的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）导致抗体依赖的细胞毒性（ADCC）升高，通过增加IgG-Fc受体IIIa（FcγRIIIa）亲和力(5, 6)，导致下一代糖工程单克隆抗体(mAb)缺乏针对肿瘤的核心岩藻糖基化作用(7)。
一般来说，Fc聚糖的变化与年龄、性别和自身免疫性疾病有关，IgG-Fc半乳糖化最明显，随着年龄的增长，半乳糖化逐渐降低。在年轻女性中，IgG-Fc半乳糖基化作用明显升高，在更年期时降低到男性的水平(8)。IgG-Fc岩藻基化作用更为稳定，在成年时从出生到大约94%略有降低(9)，此后，它保持相当稳定，但在整个生命周期中略有降低(8,10)。
尽管成年期的Fc岩藻基化作用水平明显稳定，但针对红细胞（rbc）和血小板的同种异体抗体在大多数患者中显示出显著的低IgG-Fc岩藻基化，在一些病例中甚至下降到10%(11-13)。相比之下，整体血清IgG-Fc的岩藻基化持续升高。此外，降低的IgG-Fc的岩藻糖基是决定妊娠相关的同种免疫疾病严重程度的因素之一，当岩藻糖基化抗体靶向时，导致过度的血小板减少和红细胞破坏(12-14)。除了针对血小板和红细胞抗原的特异性岩藻糖基化IgG反应外，这种反应仅被鉴定为针对艾滋病毒和登革热病毒(15,16)。有趣的是，抗HIV抗体的低核心岩藻基被认为是感染的控制者的一个特征，而对于登革热，它与由于过度FcγRIIIa激活而导致的病理增强有关(15,16)。然而，控制IgG核心岩藻基的机制仍不清楚。
在各种同种免疫反应(11-13,17)、HIV(16)和登革热(15)中也发现了类似的岩藻糖基化IgG，它们都是针对表面暴露的、膜嵌入的蛋白质。因此，我们分析了IgG糖基化在抗人血小板反应和包膜病毒自然感染中的作用。包膜病毒包括人类免疫缺陷病毒（HIV）、巨细胞病毒（CMV）、麻疹病毒、腮腺炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）。我们还评估了非包膜病毒（细小病毒B19）、乙肝病毒蛋白亚基接种和包膜减毒活病毒的反应，以测试抗原背景是否是IgG-Fc糖基化的重要决定因素。
通过串联液相色谱-质谱（LC-MS）对亲和纯化的总抗体和抗原特异性抗体进行IgG-Fc糖基化（图1）(12,17,18)。针对同种异体抗原人血小板抗原（HPA）-1a的抗原特异性抗体的Fc岩藻糖基显著减少(14)（图2A），这与之前对其他同种异体抗原的发现类似(12,17)。与血小板和红细胞异体抗原类似(11-13,17)，对包膜病毒CMV和HIV的应答也显示出抗原特异性IgG的显著岩藻糖基化（图2B）。相比之下，针对无包膜细小病毒B19的IgG被岩藻糖基化（图2C）。值得注意的是，整个免疫球蛋白g显示出高度的岩藻糖基化水平（图2，A到C），重申了之前的发现，大多数免疫球蛋白g反应导致了岩藻糖基化的免疫球蛋白g(12,18,19)。对包膜病毒的非岩藻糖基化IgG反应程度在个体和抗原类型之间高度变化，类似于对不同红细胞异体抗原的免疫反应观察(17)。非岩藻糖基化在巨细胞病毒中特别强，而在HIV中不太明显（图2B），这证实了之前在HIV中的观察(16)。非岩藻糖基化的IgG反应通常伴有半乳糖化升高。
使用蛋白G珠和抗原包被的96孔板从血清中捕获抗体，分别得到总IgG和抗原特异性IgG组分。然后，分离的IgG用胰蛋白酶消化，得到的糖肽用纳米液相色谱-质谱分析。（B和C）包含Fc糖基化位点Asn297的糖肽的代表性质谱。中性（B）和唾液酸化（C）IgG1糖肽显示在单个患者的总IgG1（上图，黑色）和抗原特异性（下图，红色）部分。星号表示非fc糖多肽。
图1. 抗体特异性IgG1糖基化质谱分析流程图
对于每个不同颜色编码的抗原组，显示了总抗体（实心圆圈）和抗原特异性抗体（空心圆圈）的IgG1-Fc岩藻糖基化水平：（A）同种异体抗原HPA-1a；（B）来自巨细胞病毒和HIV的病毒包膜抗原；（C）细小病毒B19的非包膜病毒抗原；（D）HBsAg—自然感染乙肝病毒的人（左）或接种重组可溶性HBsAg的人（右）；（E）自然感染腮腺炎病毒（左图）或接种减毒活疫苗（右图）的个体中的腮腺炎病毒抗原。每个圆圈都代表一个生物复制，（n=80为抗HPA-1a（a），n=65为巨细胞病毒，n=40为HIV（B），n=22为B19（C），代表性LC-MS运行中，HBV自然感染者n=17，HBV疫苗接种者n=17（D），腮腺炎病毒自然感染者n=24，腮腺炎疫苗接种者n=21（E）。对（A）、（B）和（C）进行配对t检验，并对（D）和（E）两组之间的Fc岩藻糖基化进行混合模型双向方差分析，对事后t检验进行Bonferroni校正。仅显示统计上显著的差异。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001和****P＜0.0001。
图2. 外来膜蛋白抗原，如（减毒）包膜病毒的包膜蛋白或异体抗原，可引起非岩藻糖基化的IgG反应
为了测试某些个体是否比其他个体具有更强的内在能力来产生岩藻糖基化的IgG反应，我们比较了同一个体中IgG1-Fc对两种不同抗原的岩藻糖基化水平。在同一个体内，比较两种不同抗原之间的非岩藻糖基化水平没有观察到相关性，既不是抗hpa-1a和抗CMV，也不是抗HIV和抗CMV抗体。因此，非岩藻糖基化水平不是由一般的宿主因素如遗传学预先决定的，而是相当随机的或多因素的，具体的触发因素仍不清楚。
为了进一步研究强效非岩藻糖基化IgG形成的免疫学背景，我们比较了不同背景下对相同病毒抗原的免疫应答。首先，我们比较了自然感染乙肝病毒或接种重组HBsAg蛋白的人乙肝表面抗原（HBsAg）特异性抗体糖基化（图2D）。两组的总IgG1-Fc岩藻糖基化水平相似，而与自然感染组的总IgG或抗原特异性IgG1-Fc岩藻糖基化相比，接种HBsAg蛋白的个体中抗HBsAg IgG1-Fc岩藻糖基化升高（图2D）。因此，在清除自然感染的个体中，HBsAg特异性抗体显示出较低的Fc岩藻糖基化程度。这强烈地表明，抗原刺激的特定背景是需要岩藻糖基化的IgG反应。
然后，我们比较了自然感染或减毒活病毒接种后形成的腮腺炎和麻疹病毒的抗病毒IgG反应。与HBV疫苗不同，两种减毒活疫苗与天然感染的同类疫苗相比均显示相似的抗原特异性Fc岩藻糖基化作用（图2E）。麻疹产生岩藻糖基化IgG的趋势较弱，而腮腺炎反应通过任何免疫途径都显示出明显的岩藻糖基化迹象（图2E）。
然后我们测试了这种反应是否在新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者中也起作用。COVID-19的症状非常多样，从无症状或轻度自限性感染，到导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的严重气道炎症，往往会产生致命后果(20,21)。两种极端轨迹的初始反应相似：患者约有一周相对较轻的症状，随后出现第二波，要么治愈疾病，要么导致严重危及生命的表型(20,21)。两种反应类型的时机和不同的临床结果都表明免疫系统采取不同的途径来对抗疾病。到目前为止，还没有明确的证据能够区分这两种假设的免疫途径。根据我们的假设和对其他包膜病毒的反应观察，对SARS-CoV-2刺突蛋白（S）的抗S IgG反应，表达在细胞表面和病毒包膜上，强烈倾向于低水平的核心岩藻糖基化。相比之下，对核衣壳蛋白（N）的反应是高水平的岩藻糖基化（图3A），核衣壳蛋白不表达于细胞表面/病毒包膜上。IgG反应似乎对SARS-CoV-2具有高度特异性，因为在疫情爆发前的样本中，即使对更保守的N抗原，对SARS-CoV-2抗原的反应都非常弱或不存在(22)。重要的是，最近在重症监护病房住院（＜5天）的ARDS患者的抗S IgG1反应明显低于由无症状或相对轻微症状(非ARDS)的恢复期血浆供者（图3A）。
Fc岩藻糖基化，（B）半乳糖基化，（C）唾液酰化，和（D）来自ARDS患者和非ARDS供体的抗S、抗N和总IgG1的平分度，从最初筛查中无症状或轻度症状清除感染。（E~L）急性呼吸窘迫综合征患者[（E），（F），（I），（J）]和非急性呼吸窘迫综合征患者[（G），（H），（K），（L）]中抗S [（E）到（H）]和抗N[（I）到（L）]的纵向IgG1-Fc岩藻糖基化和IgG数量。（M）anti-N和anti-S IgG1-Fc岩藻糖基化的相关性。（N）通过用糖工程化的IgG复合物（有或没有聚肌胞苷酸（poly（I：C））刺激）从FcγR-触发巨噬细胞释放IL-6的代表性实例。（O）血浆IL-6水平与抗S IgG1-Fc岩藻糖基化程度的相关性。（P）血浆CRP水平与抗S IgG1-Fc 岩藻糖基化程度的相关性。每个循环代表一个生物重复（n=20（ARDS），n=23（非ARDS）[（a）~（D）]，n=17（纵向ARDS）和非ARDS（纵向ARDS），n=14（E）~（L）]。LC-MS数据的技术重复示例如图s1c所示。IgG数据[（F），（H），（J），和（L）]是用两个技术实验的标准池校准的具有代表性的ELISA值。（M）中使用的所有可用配对数据（n=40）。通过ELISA测量由巨噬细胞产生的IL-6，每个点（n＝3）代表技术重复（N）。所有六个生物学复制品示如图S13所示。使用所有可用的配对数据，通过MSD从临床参数和IL-6数据获得CRP和IL-6水平[n=82（O）和n=53（P）]。统计分析采用混合模型双因素方差分析和事后t检验的Bonferroni校正来比较组间糖基化特征和细胞因子分泌。（O）到（P）进行Spearman相关性分析。为了检验anti-S和anti-N的Fc岩藻糖基化水平之间的相关性，进行了Pearson相关性分析。只有统计上的显著差异被显示。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
图3. COVID-19危重患者Fc靶向性IgG1水平明显降低
抗S IgG的Fc岩藻糖基化水平降低不是炎症的结果，因为两组之间的总IgG-Fc岩藻糖基化水平与报道的一般人群（~94%）相似(12,18)。此外，与总IgG相比，IgG1-Fc半乳糖化和唾液酸化反应均显著增加（图3，B和C），这与近期免疫中Fc半乳糖化和唾液酸化反应增加的报道一致(18,23)。在ARDS患者中，IgG1-Fc总半乳糖化和唾液化水平显著降低，这可能反映了两组之间存在轻微的年龄差异[非ARDS供体中位年龄（IQR）为49（40~55）岁，而ARDS患者为60（55~63）岁。值得注意的是，Fc半乳糖化和唾液化都随着年龄的增长而减少(9,19)。抗原特异性IgG1-Fc的半乳糖化和唾液酸化作用增加，使补体活性提高约3-4倍。Fc半乳糖化进一步增强了非岩藻糖基化IgG对FcγRIII的亲和力，约为原来的两倍(24)。最后，尽管在抗N和抗S反应中Fc平分显著降低（图3D），但其生物学和临床意义有限，因为IgG-Fc平分既不影响Fc受体也不影响补体活性(24)。更重要的是，越来越多的证据表明，IgG-Fc糖基化的主要生物学相关变化是缺乏核心岩藻糖基。非岩藻糖基化IgG对FcγRIIIa的亲和力有20-40倍的增加，通常伴随着非岩藻糖基化从无细胞反应到强吞噬和ADCC反应的绝对变化(5,15,24,25)。急性呼吸窘迫综合征患者抗S反应中Fc岩藻糖基化的降低表明了FcγRIIIa的病理作用，类似于之前提出的登革热(15)。在登革热中，以前其他登革热血清型感染形成的非中和抗体也往往具有低水平的核心岩藻糖基化IgG。由于它们无法预防感染，它们导致免疫细胞Fcγriia介导的过度反应加剧登革出血热(15)。
ARDS患者在ICU住院后1周内采样，非ARDS患者为康复期非住院患者。为了消除随时间推移观察到的IgG-Fc糖基化模式中可能的取样偏差，我们还分析了两组的纵向样本(26)。血小板和红细胞抗原的同种抗体Fc 岩藻糖基化至少可以稳定10年，无论是否通过妊娠(12,14)或输血(27)的自然增强剂。这也适用于抗巨细胞病毒和抗HIV反应。相比之下，SARS-CoV-2患者在ICU住院后的第一周已经观察到所有糖基化特征的变化（图3、E-L。S8和S9）。这些Fc半乳糖基化观察到的变化与之前的报道一致，即最近的免疫伴有抗原特异性IgG-Fc半乳糖基化和唾液酸化的短暂升高(18,23)。血清转换后，与非ARDS患者相比，所有ARDS患者最初表现出低水平的抗S IgG岩藻糖基化。ARDS患者Fucosylation水平上升随着时间的推移,水平相当的non-ARDS队列（图3，E，G）。增加岩藻糖基化水平与免疫球蛋白水平的同时增加（图3、E，H，S10，A和B），non-ARDS队列中那样明显。在anti-N IgG水平上观察到类似的动力学（图3，J和L）。在ARDS组中，anti-N Fc岩藻糖基化水平也降低了，尽管程度低于anti-S（图3，I，K和图S11）。这种在ARDS队列中看到的抗N IgG岩藻糖基化的意外减少可能是经典的旁观者效应的结果(28)。也就是说，在相同的淋巴器官中增殖的B细胞从抗原提呈细胞和T细胞那里获得了类似的环境信号。anti-S和anti-N的IgG1-Fc岩藻糖基化与anti-S更高水平的岩藻糖基化显著相关（图3M）（P＜0.0001）。在其他糖基化性状上也观察到显著的相关性，抗S和抗N IgG也存在类似的偏倚。抗原特异性IgG1-Fc半乳糖化和唾液酸化水平的升高与先前的报道一致，表明这些是新形成的持续免疫反应的一般特征(18,23)。在整个观察期间，总IgG1-Fc岩藻糖基化保持稳定（图1）。
然后，我们想知道这些岩藻糖基化的抗SARS-CoV-2抗体是如何促进ARDS患者的强烈炎症反应的。肺泡巨噬细胞是肺的前线清道夫，并表达FcγRIIIa，主要的骨髓感觉受体的非岩藻糖基化IgG。因此，我们研究了它们刺激促炎细胞因子白细胞介素（IL）-6产生的潜力，IL-6是人类急性期反应中最关键的细胞因子(29)。非岩藻糖基化IgG与toll样受体（TLR）3配体一起，在体外增强巨噬细胞产生IL-6，特别是使用非岩藻糖基化和高半乳糖化IgG时，这在ARDS患者中明显存在（图3N）。抗S IgG1-Fc岩藻糖基化与血浆IL-6和c反应蛋白（CRP）水平显著相关（图3，O和P），这与我们的假设一致，即岩藻糖基化抗SARS-CoV-2 IgG在COVID-19发病中发挥重要作用。血浆IL-6和CRP水平在出现岩藻糖基化的抗S IgG前后升高，这表明有直接的因果关系（图4，a和B）。血浆D-二聚体水平也有这种时间模式。因此，在一些患者中，岩藻糖基化和高半乳糖基化的抗S和抗N IgG可能会导致促炎细胞因子的过度释放，并随后引发全身炎症，因为它们增强了与肺泡巨噬细胞FcγRIIIa的结合能力(24)。在非ARDS病例中，未观察到IL-6或CRP升高（图4、C、D）。
（A和C）在ARDS队列[（A）和（B）]和非ARDS队列[（C）和（D）]中抗S IgG岩藻糖基化和抗N IgG岩藻糖基化和（B和D）IL-6和CRP水平。每个小组代表纵向生物复制的质运行, C反应蛋白从临床参数,获得和使用验证中尺度发现IL-6数据分析（B）和（D）（n=12ARDS和n=14non-ARDS，2到16纵向复制每个病人表示）。其他非ARDS样本见图S15。哈希符号表示这些点之前的样品低于IgG1-糖基化分析的检测限。（A）和（B）中的纵虚线表示ICU住院和出院时间（黑色）或死亡时间（红色），（B）和（D）中的横线虚线表示IL-6和CRP检测限。
图4. 抗SARS-COV-2 IgG1 Fc岩藻糖基化、CRP和IL-6的纵向变化
总之，我们的结果显示了一种针对膜嵌抗原的非岩藻糖基化IgG1免疫应答模式，如血细胞上同种抗原的表面膜蛋白或包膜病毒（包括减毒包膜病毒疫苗，通常完成第一轮感染）。这与可溶性蛋白抗原和非包膜病毒形成对比，这些抗原和病毒的免疫反应与高水平的IgG1-Fc岩藻糖基化一致。虽然COVID-19患者中有岩藻糖基化的抗N IgG，但在血清转换后1-2周不再是这种情况。
我们假设B细胞通过结合B细胞受体和未描述的宿主受体-配体对提供的至少两种信号直接感知抗原提呈膜。这两步机制将是必不可少的生产长期非岩藻糖基化不会引发免疫球蛋白反应和可溶性蛋白质，内部包膜病毒的蛋白质,或非包膜病毒（图5）。另外，微分抗原识别可能更复杂，需要额外的交互从抗原提呈细胞、T细胞和/或细胞因子。这一观点得到了一个事实的支持，即抗N型SARS-CoV-2反应与抗S反应同时发生，这表明淋巴微环境中的近端因子可以影响这种反应。
对可溶性蛋白抗原的免疫反应：B细胞受体（BCR，一种膜免疫球蛋白）被激活，导致正常岩藻糖基化抗体的产生。（B）对于同种异体抗原的免疫应答，红细胞（RBC）上的父性同种异体抗原被BCR识别，可能也被其他未描述的免疫调节受体-配体对识别自身的信号识别。（C）对于包膜病毒感染和减毒病毒的免疫应答，B细胞对包膜病毒感染细胞的识别类似于对细胞异体抗原的识别（B）。最初的识别可能会发生在包膜病毒感染细胞和/或病毒组装之后（最右）。（B）和（C）中提出的信号导致B细胞糖编程改变，最终形成独特的IgG反应，其特征是低Fc 岩藻糖基化（红色三角形=岩藻糖）和增强的ADCC。这个模型可能解释了为什么对可溶性蛋白、非包膜病毒和细胞病原体（如细菌）的免疫反应不同于对包膜病毒（和减毒病毒）的免疫反应。此外，这也可以解释为什么对同种抗原的免疫反应在免疫学上类似于包膜病毒感染。
图5. 解释不同抗原环境如何产生改变的免疫信号，从而引起改变的IgG糖基化的假设模型
这项研究表明，在宿主细胞膜的背景下提供外源B细胞抗原可能是必要的，但不足以触发长期高水平岩藻糖基化IgG的免疫反应(17)。这转化为个体间不同的Fc岩藻糖基化水平，以及同一个体对不同抗原的不同反应。在患者之间观察到的抗原特异性岩藻糖基化反应水平的巨大差异有助于疾病严重程度的变化，正如新生儿同种免疫细胞减少症(12,13,17)和登革热(15)所显示的那样。在此，我们也表明了其对新冠肺炎发病机制的重要性。因此，非岩藻糖基化可能有助于预测疾病轨迹，并指导未来的治疗，旨在最大限度地减少FcγRIIIa刺激。
重要的是，IgG-Fc非岩藻糖基化可导致强大的免疫反应。即触发表达Fcγriia的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞以及表达Fcγriiib的粒细胞破坏靶细胞。这种反应在某些反应中可能是可取的，如对艾滋病毒(16)的反应，并且可以通过现有的减毒包膜病毒疫苗(30)来实现，以疫苗为基础的方法已失败的目标。然而，这一现象也可能导致不良的夸张反应，登革热病毒(15)和SARS-CoV-2就是如此。运送SARS-CoV刺突蛋白的减毒病毒疫苗已知可产生强抗体依赖的增强反应(31)，模拟SARS-CoV-2危重患者的病理(21)。这表明，在SARS-CoV-2大鼠模型中，疫苗可能是一种更安全的选择(32)，除非该疫苗也能产生强烈的中和作用，从而有助于加强保护。
抗S IgG的非岩藻糖基化可能导致部分患者COVID-19加重，导致ARDS。因此，尽管抗体具有保护作用，但它们可能像一把双刃剑，并可能促进观察到的细胞因子风暴(33)。因此，这对改进IVIg、恢复期血浆和疫苗疗法的发展产生了直接影响。此外，非岩藻糖基化抗体在SARS-CoV-2发病机制中的作用可能为COVID-19的治疗提供更多机会。因此，尝试产生高滴度的免疫球蛋白治疗，最好使用浓缩抗SARS-COV-2抗体的血浆。这可能避免症状的升级，并在患者出现岩藻糖基化性IgG反应之前优先促进病毒中和。
一、病例资料
患者样本来源：使用来自荷兰阿姆斯特丹Sanquin的健康献血者样本用来分析细小病毒B19 （n=22），麻疹病毒（n=24自然感染，n=21减毒活疫苗疫苗），腮腺炎病毒（n=24自然感染，n=21减毒活疫苗疫苗），和乙肝病毒抗体（n=17自然感染，n=17HBsAg接种疫苗）。Anti-HPA-1a的样本已经在其他地方描述过了(14)。来自阿姆斯特丹HIV感染和艾滋病队列研究（ACS）的HIV样本（n=80）用于分析HIV特异性抗体糖基化。用于纯化CMV特异性抗体（n=102）的外周血样本与用于HPA-1a的样本来自芬兰赫尔辛基的芬兰红十字血站、血小板免疫实验室和上述HIV队列。包括来自阿姆斯特丹UMC COVID-2研究组ICU患者的SARS-CoV-2患者样本，发现血清SARS-CoV-2阳性的Sanquin献血者，以及潜在接触后监测的医院工作人员的轻度纵向样本(26)。表S1对患者的人口统计情况进行了总结，表S2对COVID-19急性呼吸窘迫综合征患者的详细治疗情况(全部需要通气)进行了总结。ACS是按照《赫尔辛基宣言》中规定的伦理原则进行的，所有参与者都提供了书面知情同意。该研究得到了阿姆斯特丹大学学术医学中心机构医学伦理委员会的批准。
二、研究方法
1. 血清中CMV特异性抗体的纯化：CMV特异性抗体用抗原涂层板纯化（血清ELISA经典，巨细胞病毒IgG，维尔茨堡，德国）。将20μl的血清用试剂盒中的标本稀释液（80μl）稀释，37℃平板孵育1小时。试剂盒阳性和阴性对照和CMV阴性患者样本作为对照。用试剂盒中的洗涤缓冲液（300μl）洗涤平板3次，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（300μl）洗涤2次，用去离子水（300μl）洗涤2次。结合抗体再用100μl 100mM甲酸洗脱。空白孔和CMV阴性患者样本的洗脱液中未发现IgG。
2. 血清中麻疹和腮腺炎病毒特异性抗体的纯化：使用抗原涂层板纯化Ag特异性抗体（血清ELISA经典，麻疹IgG和腮腺炎IgG，维尔茨堡，德国）。将20μl的血清用试剂盒中的标本稀释液（80μl）稀释，37℃平板孵育1小时。使用试剂盒中的阳性和阴性对照。用试剂盒中的洗涤缓冲液（300μl）洗涤3次，PBS（300μl）洗涤2次，50mm碳酸氢铵（300μl）洗涤2次。结合抗体再用100μl 100mM甲酸洗脱。阳性对照洗脱液中检出IgG，空白孔和阴性对照洗脱液中未检出IgG。
3. 血清中HBV特异性抗体的纯化：采用HB抗原涂层板（etia-ab-auk-3，Diasorin，Schiphol-Rijk，荷兰）从感染和接种后的患者中分离HBsAg特异性抗体。将20μl的血清用试剂盒中80μl的标本稀释液稀释后，室温摇匀孵育1小时。采用来自荷兰阿姆斯特丹Sanquin市的HBV初治和HBV溶解样本作为对照。对CMV特异性抗体进行如上所述的特异性抗体的清洗和洗脱。
4. 血清中HIV特异性抗体的纯化：采用HIV抗原涂层板（Murex HIV1.2.0 kit 9E25-01，Diasorin，Schiphol-Rijk，The Netherlands）分离HIV特异性抗体。取50μl标本稀释液稀释（50μl），室温摇匀孵育1小时。阳性对照采用抗HIV单克隆抗体gp120Ig G1 b12；100μg纯化的抗体以1mg/ml的PBS；美国国立卫生研究院艾滋病试剂计划（La Jolla，CA，usa）。对CMV特异性抗体进行如上所述的特异性抗体的清洗和洗脱。
5. 血清中细小病毒B19特异性抗体的纯化：采用细小病毒B19抗原涂层板（Abcam1788650-抗细小病毒B19 IgG ELISA，剑桥，英国）分离细小病毒B19特异性抗体。将20μl的血清用试剂盒中80μl的标本稀释液稀释后，室温摇匀孵育1小时。采用试剂盒阳性和阴性对照作为对照。对CMV特异性抗体进行如上所述的清洗和洗脱特异性抗体。
6. 血浆中抗N和抗S特异性抗体的纯化：采用抗原涂层板（NUNC，Roskilde，Denmark）纯化SARS-COV-2特异性抗体。4℃将重组三聚体刺突蛋白(34)或N蛋白[GenBank：MN908947，由HAVT20前导肽在HEK细胞中产生，10倍His tag和一个BirA tag(24)]在PBS（分别为5μg/ml和1μg/ml）中涂膜过夜。用补充0.05%TWEEN 20®（PBS-t）的PBS（250μl）洗涤3次。血浆（20μl）用PBS-T（180μl）稀释，室温振荡孵育1小时。以COVID-19大流行前的血清作为阴性对照。PBS-t（250μl）洗3次，PBS（250μl）洗2次，250μl碳酸氢铵（50mM）洗2次。结合抗体用100mM（200μl）甲酸洗脱。
7. 血清总IgG的纯化：总IgG1 2μl的捕获抗体血清使用蛋白G琼脂糖4快流珠（通用电气医疗集团，乌普萨拉，瑞典）96孔滤板（微孔多屏幕，阿姆斯特丹，荷兰）如前所述(12)或通过使用蛋白G墨盒AssayMAP布拉沃（美国圣克拉拉安捷伦科技）。简单地说，1μl的血清稀释在PBS上，然后用PBS和LC-MS纯水清洗。IgG抗体然后用1%甲酸洗脱。
8. 质谱IgG-Fc糖基化分析：将含有抗原特异性抗体或总IgG的洗脱液收集于v型底板，50℃真空离心干燥2.5小时。HPA1a、CMV、HIV、细小病毒B19、HBV和COVID-19样本随后使用如上所述的胰蛋白酶进行蛋白水解切割(12)。麻疹和流行性腮腺炎样本溶解在含有0.4%去氧胆酸钠（SDC）、10mM TCEP、40mM氯乙酰胺和100mM TRIS pH 8.5的缓冲液中。在95℃孵育10分钟后，加入250ng胰蛋白酶在50mM碳酸氢铵中。通过酸化至2%甲酸，在孵育过夜后停止消化。在MS注入之前，SDC沉淀物通过20,000g离心样品30分钟来去除。IgG fc-糖基化分析采用nanoolc反相（RP）-电喷雾（ESI）-MS，在一个最终3000 RSLCnano系统（Dionex/Thermo Scientific，Breda，荷兰）结合amaZon速度离子质谱仪（Bruker Daltonics，Bremen，德国）进行，如前面所述(12)。另外，如前所述，麻疹、腮腺炎和COVID-19队列使用四极杆飞行时间质谱分析法(Bruker Daltonics)进行测量(35)。在本研究中，我们主要关注IgG1，而没有分析IgG3，因为它可能在糖肽水平上干扰IgG2和IgG4(36)。质谱结果提取和评估使用数据分析软件（5.0版）除麻疹、腮腺炎和COVID-19队列外，所有样本均使用Skyline软件（4.2.19107版本）进行分析。当所有糖肽类的信号强度之和（表S3）高于阴性样本加上其标准分割的10倍时，判断数据是可靠的。否则，数据被排除(12)。糖基性状总水平的计算如表S4所示（表1）。
表1. 糖基性状总水平的计算
9. 细胞因子释放试验：单核细胞从血沉棕黄层中分离出来，如前所述(37)，使用M-CSF和IL-10进行分化。这导致了类似肺泡巨噬细胞样单核细胞来源的巨噬细胞的表型(37,38)。为了产生IgG免疫复合物，将2μg/ml糖工程蛋白IgG1(39)在96孔高亲和板（Nunc；鲁开德；丹麦）上的PBS中包被过夜。巨噬细胞（50,000/孔）在图例中描述的预涂板中结合20μg/ml poly（I:C）（Sigma-Aldrich）刺激。为了测量IL-6的产量，在刺激24小时后收集上清。然后使用IL-6 ELISA试剂盒检测IL-6，试剂盒使用说明书（U-CyTech Biosciences）。包衣抗体和检测抗体均按1:200稀释。
10. Meso Scale Discovery多重测定：V-PLEX定制人细胞因子10-plex试剂盒购自Mesoscale Discovery（MSD）。将混合校准物分别在提供的测定稀液中重组。血浆和血清（10μl）用40μl MSD样品稀释液稀释，测定IL-6。按照生产商说明进行检测，稀释后的样品和标准品在4℃孵育过夜。采用MESO QuickPlex SQ 120读板器（MSD）检测电化学发光信号（ECL），并使用Discovery Workbench软件（v4.0，MSD）进行分析。
11. 抗SARS-CoV2抗体水平：ELISA法测定抗体水平。简单地说，样品在含有0.1%聚山豆酸酯-20和0.3%明胶（PTG）的PBS中以100-1200倍稀释进行测试，在微滴度板上涂有S或N蛋白，并在室温下孵育1小时。这两种蛋白都像前面描述的那样产生(26)。洗涤后，加入0.5μg/ml酶标抗人IgG（MH16-1，Sanquin），并在室温下孵育1小时，TMB底物酶转化后，在450nm和540nm处测定吸光度。通过与100AU/ml的COVID-19恢复期患者参考血浆库的比较来评估抗体结合。
三、统计分析
使用适用于Windows的GraphPad Prism（8.0.2版）（GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA，www.graphpad.com）进行统计分析。为了分析总IgG和抗原特异性IgG的fc岩藻糖基化在被检测队列之间是否存在差异，按照单个队列的规定，使用双向方差分析和配对t检验进行统计分析。同样的试验也用于比较由受刺激的巨噬细胞释放的细胞因子。为了调查同一个人中两种特异性抗体的Fc 岩藻糖基化水平是否相关，使用Pearson相关性进行统计分析。用Pearson相关性检验抗S和抗N IgG的Fc-岩藻糖基化之间的相关性。为了检测细胞因子释放与IgG Fc-岩藻糖基化之间的关系，以及抗S- Fc岩藻糖基化的程度与CRP水平之间的关系，我们进行了Spearman相关性研究。只有统计上的显著差异被显示。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
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