细菌异质性耐药及检测技术最新进展
作者：韩塔拉 刘柔杉 王俊瑞
异质性耐药被发现存在于几乎所有临床常见细菌性病原中，给实验室准确检测和报告细菌耐药性及临床抗感染治疗提出更大的挑战和困难。异质性耐药是一种特殊的细菌耐药类型，指细菌的不同亚群对某种抗菌药物表现出不一致的耐药特征，一般表现为大部分亚群敏感而一小部分亚群为耐药，极少数亚群可能出现高水平耐药。尽管异质耐药性这一现象很早就被发现，但由于异质耐药性技术方法的限制、不同研究对异质性耐药定义标准的不统一、异质性耐药机制多样性等原因，异质性耐药对于临床治疗的实际影响尚缺乏充分有效的研究数据支持。近年，不断有研究报道证实了细菌异质性耐药的广泛存在以及因异质性耐药导致抗感染治疗失败所引起的严重后果。因此,进一步研究临床常见细菌对常用抗菌药物异质性耐药机制并探究标准化、易于推广应用的检测技术迫在眉睫。本文将对细菌异质性耐药的常规检测方法和新技术进展进行综述，为实验室人员和临床医师认识和重视细菌异质性耐药提供新的思路。
一、异质性耐药定义及影响因素
异质性耐药被认为是细菌耐药性进化过程中的一个中间过程。由于目前对异质性耐药的认识还不够清晰，导致异质性耐药的定义尚无统一判定标准。现在通常以El-Halfawy等[1]定义的标准作为参考，即测试菌株可分离出几种具有不同耐药程度的细菌亚群，其中1种或多种亚群对某种抗生素的耐药水平高于该菌株主要亚群的耐药程度。但Andersson DI等[2]建议判定或定义异质性耐药时应至少考虑以下几个方面的内容。首先，要考虑其异质性耐药亚群的克隆性或来源，通常异质性耐药有两种来源。第一种是由2种或多种具有不同耐药性的克隆株同时感染，即耐药克隆和敏感克隆株；第二种情况，是在治疗过程中，原来的敏感克隆株演变为异质性耐药，即主要种群仍保持敏感，少数亚群演变为耐药克隆。这两种异质性耐药方式都可以通过适当的方法进行检测。第二，要确定异质性耐药亚群出现的最小频率（即在所有亚群中的占比）和最低耐药水平。多数菌株可分离出在接近最小抑菌浓度（MIC）的抗生素环境下生长的耐药亚群。因此，通常以耐药亚群对某种抗生素MIC值与主要亚群（敏感亚群）MIC值的倍数来定义异质性耐药亚群的耐药程度。这样可保证异质性耐药不是用于描述那些仅比MIC值稍高的亚群[3-5]。El-Halfawy与Valvano[2]建议：如果耐药亚群MIC值至少高于相应菌株主要亚群MIC值8倍、且耐药亚群频率高于10-7时，可鉴定为异质性耐药[6]，而无需考虑其他因素。第三，我们还应该考虑耐药亚群的出现频率。如对结核分枝杆菌来说，1%或更高比例耐药亚群的存在被定义为异质性耐药[7]。但对于很多其他种属细菌而言，这种高比率的异质性耐药很少能检测到。由于异质性耐药检测手段的差异，耐药亚群检测限会有很大差异。对于同一个细菌亚群，被最终鉴定为敏感或耐药，可能很大程度上取决于所采用检测方法的检测灵敏度和耐药亚群的最小可接受频率。因此，确定一种细菌对不同种类抗生素或不同抗生素对同一种细菌的异质性耐药，检测方法的选择和标准的界定至关重要。第四，我们可能还要必须考虑耐药亚群的耐药稳定性，一般通过在不含抗生素培养基上连续传代的方法（如10-15代或更多）观察异质性耐药亚群的耐药性是否稳定来进行判断。如果在没有抗生素压力的情况下，耐药亚群可以恢复其敏感性，那么这种异质性耐药性就是不稳定的，也称为“不稳定异质性耐药”。相反，则称之为稳定型异质性耐药。最后，我们可能还要考虑异质性耐药亚群的培养条件[8]。例如，某些金黄色葡萄球菌菌株的异质性耐药特性呈温度依赖性；在30℃培养条件下，暴露于高甲氧西林浓度时，这类菌株可以生长；但温度增高至37℃时，30分钟内就会失去这种耐药性。温度降低在30℃以下某个温度时间，这种耐药性也将丢失[9]。
综上所述，由于检测手段的限制及不同细菌异质性耐药性的差异等因素的制约，异质性耐药的定义尚不能形成统一的标准，也很难进行回顾性比较，从而也无法客观评估其实际临床意义。但我们仍然要尽量寻找一种相对标准化或者容易标准化的定义方式。为此，适宜的检测技术的探究，特别是新技术的研发，可能是最为关键的一个研究方向。
二、异质性耐药常规检测方法
1. K-B纸片扩散法和E-Test方法：K-B纸片扩散法可通过观察在抑菌圈内菌落生长情况来检测和识别异质性耐药亚群（图1）。抑菌圈内异质性耐药亚群菌落的出现，主要取决于异质性亚群的出现频率。最近有研究采用K-B纸片扩散法从2500株革兰阴性杆菌筛选出异质性耐药菌株37株（1.48%）；其中，头孢他啶纸片筛选出28株异质性耐药菌株，阴沟肠杆菌占比最多，共9株；美罗培南纸片筛选出12株异质性耐药菌株，铜绿假单胞菌占比最多，共7株[10]。通常对于低频率异质性的分离株，抑菌圈内耐药亚群菌落出现概率很低；而异质性耐药亚群的出现频率一般介于10-5或10-7之间[11]。铜绿假单胞菌及阴沟肠杆菌的高检出率也说明这2种菌相对更容易产生异质性耐药。KB纸片法虽然是一种常规方法，但由于其成本低廉，操作简便，在特定种属细菌异质性耐药初筛中具有一定的应用价值。
图1. K-B纸片法检测金黄色葡萄球菌异质性耐药
E-Test方法与K-B纸片扩散法实验原理类似，结合了纸片扩散法操作方便、结果易读取及E-test法可直接获得MIC值的技术优势[12]。但是E-Test也是观察异质性耐药的非定量方法，也受到测试菌株异质性亚群出现频率的影响。在鉴定异质性耐药方面，E-test法鉴定同样存在与K-B纸片扩散法类似的技术缺陷[13]。E-Test的另一个缺点是条带价格较为昂贵，不适合常规筛查使用。
2. 菌群分析法（Population analysis profiling，PAP）：PAP是目前公认为检测异质性耐药的金标准方法。基本流程为：制备大豆胰蛋白胨琼脂（TSA）平板（含梯度浓度抗生素），取实验所需浓度的对数生长期菌悬液，涂布接种至TSA平板，35℃孵育48h，观察平板上菌落数，绘制生长曲线。Liu等[14]分别将金黄色葡萄球菌OS-200菌株（苯唑西林敏感耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，OS-MRSA）及标准菌株ATCC25923培养物以109 CFU/板的密度接种到含梯度浓度的苯唑西林（0.06-800μg/mL）TSA平板上。然后将平板在有氧条件下于35℃孵育48小时，绘制生长曲线（图2）。发现OS-MRSA菌株呈现明显的异质性耐药特征，而ATCC25923菌株无异质性耐药特征。PAP法可以确定出异质性耐药菌株，并可确定其耐药频率。但不同菌属细菌对不同抗菌药物异质性耐药的定义尚无统一标准，抗生素浓度梯度设置也无标准化要求，不同实验室间结果一致性评估缺乏标准。而且PAP法实验操作步骤繁琐，成本高昂，不适用于常规开展，仅适用于确认实验。
3. 菌群分析-曲线下面积法（PAP-AUC）：PAP-AUC是一种改良的PAP方法。这种方法常被用于验证金黄色葡萄球菌对万古霉素的异质性耐药[15]，是筛选糖肽类药物异质性耐药金黄色葡萄球菌（heterogeneous glycopeptide-intermediate Staphylococcus aureus，hGISA）的常用方法。改良PAP法是将经24h培养的受试菌菌体沉淀用生理盐水稀释至一定倍数，接种于含0.5-4μg/mL万古霉素的BHIA（心脑浸液琼脂）平皿上, 37℃孵育48h后进行菌落计数。以hVISA Mu3和Mu50菌株为对照，横坐标为万古霉素浓度,纵坐标为万古霉素浓度相对应菌落数,计算曲线下面积（AUC值）。以待检菌株AUC值与质控菌株Mu3 AUC值相比，如比值≥0.9即判定为hVRSA[16]。PAP改良法在鉴定特定细菌异质性耐药方面有较好的应用价值，制定了针对特定抗生素和特定菌属细菌的标准化操作规程，但该方法操作步骤繁琐、费时费力等特点限制了该方法在常规实验室的广泛开展。
4. 时间-杀菌试验（time-kill assays）：时间-杀菌试验[17]的实验原理是通过在测试菌培养物中加入梯度抗生素，观察测试菌在一定时间段内的生长情况，并定量检测各时间点耐药亚群数量的变化，以此来评估不同菌株对特定抗菌药物的异质性耐药特征。在不同浓度抗生素作用下，培养物在实验初始阶段会生长明显减弱，之后耐药亚群会被筛选出来，并呈现快速生长的特征。通过生长曲线的变化，可以比较不同菌株耐药亚群的分布特征及比例。这种方法受菌株耐药亚群频率的影响相对较小，适用于多种革兰阳性菌和革兰阴性菌异质性耐药株的初步筛选。
表1. 异质性耐药常规检测方法概括和比较
三、细菌异质性耐药检测新技术
1. 等离子胶质体偶联基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术：来自复旦大学上海口腔医院的Dai YC团队[22]尝试探索一种基于MALDI-TOF MS（Bruker Daltonik MALDI Biotyper）的新方法，即在单细胞水平对细菌耐药性进行精准检测（如图3）。利用疏水性纳米颗粒在水油界面具有自组装的特性，通过商品化四通阀装置高通量生产直径约200μm的等离子胶质体。基本流程是将金纳米颗粒混合液由两个垂直通道对称注入（油相），将含有精氨酸Arg（内参）、氨苄西林（AMP）和一定浓度的产β-内酰胺酶大肠埃希菌（E. coli）的菌悬液经水平通道（水相）注入，水油相交界处即可产生胶质体。这种胶质体可实现对单个细菌进行包裹，经37℃孵育一定时间后，其所含产β-内酰胺酶E. coli将会水解AMP，AMP及其水解产物（AMPhydr）通过MALDI-TOF MS进行检测。
研究结果显示，胶质体经37℃孵育80min后，不同样本AMPhydr/Arg相对峰强度差异显著。AMR可分为3个层次：弱耐药性（相对强度＜0.025）、中等耐药性（相对强度0.025-0.075）、强耐药性（相对强度＞0.075）。其中，80%以上细菌呈现相对较弱的β内酰胺酶活性（＜0.075）。E.coli浓度对AMPhydr/Arg相对峰值的影响明显。与106和104CFU/mL浓度相比，105CFU/mL浓度下所得AMPhydr/Arg相对峰强度样本间偏倚最小[22]。
综上所述，等离子胶质体偶联MALDI-TOF MS方法可在单细胞水平对细菌异质耐药性进行检测。胶质体可作为MALDI-TOF MS检测的靶点，能够对抗生素分子进行准确、灵敏、快速的定量检测。在单细胞水平进行异质耐药的检测，对于细菌耐药性研究和临床抗菌药物使用具有重要的意义。
2. 拉曼光谱技术：拉曼光谱技术是一种广谱分析方法，其技术原理是对与入射光频率不同的散射光谱进行检测和分析，进而得到分子振动、转动方面的信息；也可用于分子结构检测和研究。拉曼光谱技术具有光谱学快速检测的优点，依据特定光谱模式识别方式，可高特异性地观察生物分子的变化。同时，拉曼广谱技术检测过程不受水分子的干扰，非常适合医学领域生物分子、药物活性等方面的研究，特别对于细菌耐药性的快速检测。拉曼光谱技术能够对从样本中直接分离出的致病菌进行逐个检测，在无损的状态下，获得单细胞及亚细胞细微化学结构信息，结合拉曼成像技术可准确测量个体细菌在测试药物作用下的异质性变化，如药物在菌体中的分布与动力学变化，药物与单个细菌的相互作用等，为耐药性的变迁和耐药机制研究提供了便利的工具[23, 24]。D. Bauer等[25]将拉曼光谱作为一种提供化学特异信息的非破坏性技术，用于监测抗生素治疗过程中代谢活性细菌对氘的摄取，从而实现快速可靠的抗生素敏感性试验（AST）。他们将拉曼光谱技术的AST敏感性与稳定同位素标记相结合，使该技术超越耐药或易感的二元选择，关注到耐药细菌和敏感细菌之间的灰色区域，从而对异耐药菌进行检测。根据其实验和建模数据，可在3小时内检测到高表达表型，可检测到的异质性耐药频率低至10-6。
3. 分子检测技术：分子检测技术从分子、基因、遗传的角度，通过分析基因突变等机制识别细菌异质性耐药。目前报道用于细菌异质性耐药检测的技术主要包括以下几种：
（1）微液滴数字PCR技术（ddPCR）：微滴数字PCR是一种基于泊松（poisson）分布原理的核酸分子绝对定量技术[26]。相较于传统PCR，ddPCR最大优势为它不依赖Ct值和标准曲线，而是直接计算模板中的拷贝数，实现真正意义上的绝对定量和绝对检测精度[27]。ddPCR具有高特异性、高精确度和高敏感性等优点，使其能快速被市场所接受，实现商业化。
近年，ddPCR技术在病原微生物检测领域得到了广泛应用，比如利用ddPCR技术检测克拉霉素对幽门螺杆菌的异质性耐药。克拉霉素与23S RNA的结构域肽基转移酶环（简称23S RNA）结合，抑制幽门螺杆菌的蛋白质合成[28]，该结构域的突变导致对克拉霉素的耐药性。幽门螺杆菌感染期间，如果能检测到菌株中某一亚群的异质性耐药等位基因，则可以选择克拉霉素的替代药物或增加其他种类抗生素进行治疗；相反，如果只检测到敏感等位基因，治疗方案也可相应简化，减少副作用并增加治疗成功概率。ddPCR分析可同时定量检测克拉霉素敏感和耐药的23S RNA等位基因，也可对菌株进行表型分析，通过区分突变型和野生型亚群，捕获稀有的异质性耐药单克隆表型。Lu S等[29]建立了一种使用ddPCR定量分析胃和粪便样品中幽门螺杆菌克拉霉素抗性（突变）和易感性（野生型）23S rRNA基因等位基因的方法，他们对43例培养阳性菌株进行MIC检测，20例为敏感菌株，14例为敏感和耐药混合菌株，9例为耐药菌株。ddPCR结果显示，21例受试者仅有野生型等位基因，13例为混合型，9例为突变型等位基因。因此他们认为ddPCR似乎比常规的临床耐药检测方法提供更敏感的耐药性检测。
ddPCR技术使研究者能更好地了解抗菌药物的耐药机制，以及病原体的来源和分布，有利于更好地选择治疗药物、更早地控制传播和完善对疾病的管理。但是，此项技术仍然存在一些问题有待更好完善或解决：如阈值的确定、易出现假阳性，检测成本高等。但ddPCR技术在细菌异质性耐药检测中的应用仍值得期待。
（2）其他分子检测技术：其他已报道分子检测技术主要采用PCR方法对与异质性耐药机制相关的基因或突变位点进行精准检测。在快速识别异质性耐药方面（特别是慢生长菌和苛氧菌），具有显著的技术优势。但与常规检测方法相比，分子检测技术依赖于对特定耐药机制的深入了解，也不能同时检测所有可能导致异质性耐药的靶标分子。如lpxACD基因突变[30]与鲍曼不动杆菌多黏菌素异质性耐药、MutS基因突变[31]与碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌多粘菌素异质性耐药性获得之间的相关性已被报道，这些靶基因突变位点可通过分子检测方法进行快速检测。此外，近年关于结核分枝杆菌（MTB）异质性耐药的报道越来越多。由于MTB生长缓慢，分子探针技术非常适用MTB的快速鉴定与耐药性检测。如基于巢式PCR原理的Xpert MTB/FIF技术，以利福平耐药决定区基因作为探针来检测靶序列，可以在2h内实现结核分枝杆菌鉴定及利福平耐药性的一体化加测。由于其较高的敏感性、特异性和简便性，被WHO强力推荐为基层医疗机构结核病检测方法[32]。
随着新冠疫情以及埃博拉病毒等新型高致病性病原的不断出现，分子检测技术迎来了快速发展，新的检测技术将不断涌现，异质性耐药检测及机制的认知将会大大提速。
四、结语
细菌异质性耐药性虽然已经被广泛认知，在临床实际诊疗过程中的受关注程度仍显不足。标准化、便捷的检测技术严重制约着细菌异质性耐药的实验室常规检测和临床认知。探索和评估适用于临床广泛应用的异质性耐药检测新技术和方法迫在眉睫。随着我们对常见细菌耐药机制研究的不断深入、分子检测技术的不断成熟和其他新技术的问世，细菌异质性耐药在实验室常规检测将成为可能。
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