用微滴式数字PCR 进行HEV RNA定量检测

1、简介

戊型肝炎病毒（HEV）是一种无包膜的单股正链RNA病毒。4种主要基因型已被鉴别出来，其中基因型3主要发生于工业国家。HEV 基因型3是免疫功能不全患者越来越关注的问题，因为其可导致慢性感染和肝硬化。HEV感染最好用血清学试验结合核算扩增技术来诊断。病理生理学研究和采用抗病毒疗法的慢性感染患者的HEV病毒载量监测需要准确的HEV RNA定量试验。对某些逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）方法的评估显示其灵敏度差异显著。

我们评估了一种新的HEV RNA定量方法，即逆转录酶微滴式数字PCR（RT-ddPCR），该方法能给出目标基因的绝对数量。

2、材料和方法

病毒含量经过已确认RT-qPCR方法（ISO 15189认证）定量的HEV阳性血浆样品被用于评估该逆转录微滴式数字PCR（RT-ddPCR）的分析性能。两个方法靶定的区域相同（开放阅读框（ORF3）区域的一个70 bp序列），均使用正向引物HEVORF3-S（5’-GGTGGTTTCTGGGGTGAC-3’）、逆向引物HEVORF3-AS（5’-AGGGGTTGGTTGGATGAA-3’）、和探针5’–6-羧基荧光素（FAM）–TGATTCTCAGCCCTTCGC–6-羧基四甲基罗丹明（TAMRA）–3’。用RNeasy minikit（Qiagen, Courtaboeuf, France）根据厂商说明从血浆样品（140µL）中提取出HEV RNA。50µL RT-qPCR反应混合物包含1µL SuperScript III Platinum一步法定量RT-PCR系统介质（Invitrogen by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA），20µL RNA，引物（200nM），探针（150nM），和40U/反应RNase Out（Invitrogen）。20µL RT-ddPCR反应混合物包含10µL One-step RT-ddPCR mix for Probes（BioRad, Pleasanton, CA, USA），HEV 引物（500nM）/探针（250nM）和7µL核酸。在61℃进行逆转录30分钟后，在95℃使变性5分钟，并用QX200微滴式数字PCR系统（BioRad）在95℃（30s）和56℃（1 min）下对DNA进行40个循环的扩PCR增。PCR扩增结束后，用微滴阅读仪读取阳性与阴性微滴的数量，用QuantaSoft软件（BioRad）分析PCR靶标的绝对数量。比较RT-ddPCR试验与已确认的RT-qPCR方法。用两种方法检测从感染了基因型1（n=4）、基因型3（15个3c/3i亚型和16个3e/3f亚型）和基因型4（n=10）的45位HEV患者收集的临床标本。用XLSTAT软件（版本14, Addinsoft, Paris, France）进行统计学分析。

3、结果

3.1 RT-ddPCR试验的分析性能

用HEV阴性血浆将国际标准品（Paul Ehrlich Institute, Langen, Hessen, Germany；基因型3a）连续稀释为1000（重复测量5次），200、100、50和20 HEV RNA国际单位（IU）/mL（每个浓度重复测量15次），测定检测限。概率单位分析预测检测限（LOD）为80（95%置信区间：61-156）HEV RNA IU/mL。在15个独立系列中阴性血浆样品被测试26次。所有RT-ddPCR微孔都是阴性。在同一个试验中交替测试12份阴性样品与阳性样品（6 log copies/mL），评估交叉污染的风险。所有阴性样品都没有出现阳性信号。对从含4.7 log copies/mL的血浆样品中提取的HEV RNA重复测量8次，评估批内再现性。批内标准差（SD）是0.05，变异系数（CV）是0.97%，均值是4.7 log copies/mL。将国际标准品稀释至3.1 log copies/mL，评估批间再现性。在6个独立的RT-ddPCR系列中进行测试。批间SD是0.1，CV是4%，均值是3.3 log copies/mL。将HEV基因型1、基因型3和基因型4阳性血浆连续稀释（106-200 copies/mL），重复测量3次，计算该方法的动态范围。由于缺乏可用样品，没有检测HEV基因型2。每个浓度的观测均值和SD如表1所示。回归分析显示基因型1的y=1.008x-0.1002、R2=0.990。基因型3的y=1.028x-0.1275、R2=0.998，基因型4的y=0.9564x-0.1495、R2=0.986。无法分析106 copies/mL以上的浓度；样品稀释是强制性的。

表1. 用逆转录酶微滴式数字PCR（RT-ddPCR）测定的戊型肝炎病毒（HEV）RNA数量的线性。每个浓度重复测量三次。

3.2 RT-ddPCR与RT-qPCR之间HEV RNA定量的比较

用两个方法测试来自45位HEV感染患者的血浆样品（HEV RNA浓度超过6 log copies/mL的样品按照1/100稀释）。Passing-Bablock回归分析明确RT-ddPCR为（（0.998×RT-qPCR）-0.42）（图1）。Bland-Altman分析表明RT-qPCR显示的病毒载量稍高于RT-ddPCR，平均差异在0.42 log copies/mL。因而，RT-qPCR方法可能高估HEV RNA浓度（图2）。两个方法间的相关性良好（Spearman rs=0.89, p<0.0001）。两份样品（1份3e亚型和1份3c亚型）无法被RT-ddPCR定量。

图1. 用逆转录酶微滴式数字PCR（RT-ddPCR）和逆转录酶定量PCR（RT-qPCR）测定的戊型肝炎病毒（HEV）RNA浓度的Passing-Bablock回归分析。红线代表Passing-Bablock回归线，虚线代表标识线而灰线代表回归线的置信区间。点代表RT-qPCR和RT-ddPCR测定的每个样品的HEV RNA浓度。

图2. 用RT-qPCR和RT-ddPCR测定的HEV RNA浓度之间的一致性。Bland-Altman图比较了RT-qPCR和RT-ddPCR获得的HEV RNA数量。实线表示差异平均值（n=0.42 log HEV RNA copies/mL），虚线表示平均值±2倍标准差。空心圆代表基因型1，实心圆代表基因型3而正方形代表基因型4。从Bland-Altman分析中排除了未被RT-ddPCR测试的两份样品。

4、讨论

因此，我们的数据表明用RT-ddPCR对HEV基因型1、3和4进行定量时性能良好。基于ORF3（SD=0.15–0.21），批间再现性与RT-qPCR方法相似。基于ORF3（20–100 HEV RNA IU/mL），灵敏度可与实时PCR方法比较。不同基因型的HEV RNA可以用相似动态范围的RT-ddPCR进行定量。引物/探针与HEV参考序列的序列比对显示基因型1-7之间没有序列不匹配或者只有一个非关键位置不匹配（数据未显示）。这涉及到在实时PCR试验中引物/探针检测基因型1-4 HEV毒株的能力。

ddPCR的一个局限性在于必须稀释包含高浓度目标分子的样品。反应在高浓度时不是线性，因为系统不再能区别阳性和阴性微滴。本研究测试的HEV RNA浓度在6 log copies/mL以上的样品只有在稀释后才能准确定量。我们的RT-qPCR试验表明无法被RT-ddPCR定量的两份样品具有较高的HEV RNA浓度：6.73和7.66 log copies/mL。即使稀释100倍后也无法区分阳性和阴性微滴。这个问题可能是人为的，因为所有其他高浓度样品被稀释后都可以被定量。放弃了引物或探针问题，因为RT-qPCR方法使用了相同的引物/探针。我们无法排除这两份样品是否存在基质问题，从而妨碍正确分析。

ddPCR方法给出了HEV RNA的绝对数量，不需要标准曲线。标准曲线通常是用质粒或转录本生成的，可导致不同RT-qPCR试验的定量差异。这可以很好地解释与RT-ddPCR相比，RT-qPCR高估了HEV RNA浓度。RT-ddPCR可用于生成一组校准HEV毒株，更精确地评估核酸测试试验对于HEV RNA的灵敏度，各种核酸试验间的灵敏度差异显著。因此，ddPCR试验不仅在血液样品，而且在食品和水样中有希望成为HEV RNA定量标准化的工具。

（摘自Viruses，版权归其所有，仅供内部参考）

编译：王小茜